高温高压加热受试物对细菌回复突变试验的影响

高温高压加热受试物对细菌回复突变试验的影响

1受试物影响自1975年建立以来，细菌恢复突变试（以下简称ases试验）已在世界范围内广泛使用。高温高压对含碳水化合物、生物活性成分等类型的受试物影响巨大,经过高温高压后可能会产生蛋白变性、生物活性降低或丧失、有效成分挥发等情况,虽然大部分致畸物(致癌物)化学性质都比较稳定,但经过高温高压后可能会挥发、解离或产生构型变化。这很可能影响Ames试验对受试物评价的客观性和科学性。为了研究高温高压灭菌对评价受试物致畸性的影响,本研究采用Ames试验常用阳性物为对象,水及保健食品为基质经高温高压处理后,研究阳性物诱导自发回变的效率变化情况。2材料和方法2.1菌株和标准物0.5mmol/L组氨酸-生物素溶液(诱变实验用,L-组氨酸购自西格玛,D-生物素溶液购自国药集团);顶层琼脂培养基(琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司,氯化钠购自国药集团);底层培养基(琼脂培养基、葡萄糖溶液购自北京索莱宝科技有限公司;磷酸盐购自国药集团);北京陆桥的营养肉汤;美国millipore的0.22nm无菌滤器;上海治宇医疗器械有限公司的10mL无菌注射器;美国康宁的50mL离心管。标准菌株全部来自于MOLTOX,名称及菌株编号如下:TA97(4710D)、TA98(4703D)、TA100(4711D)、TA102(4712D);阳性物名称、来源及批号如下:甲基磺酸甲酯(百灵威、L650043);敌克松(Sigma-Aldrich、SZBDO22xv);1,8-二羟蒽醌(百灵威、LS30N53);2-氨基芴(索莱宝、131B102);叠氮钠(索莱宝、809B053);2-氨基蒽(Sigma-Aldrich、XTBD3302V)。2.2u3000竞争优势MS205DU型电子天平(瑞士梅特勒-托勒多国际有限公司);MLS3780型高压灭菌锅(日本三洋电机公司);1300系列A2级生物安全柜(美国赛默飞世尔科技有限公司);KB115型生化培养箱(德国BINDERGmbH公司)。2.3实验方法依据GB15193.4-2014《食品安全国家标准细菌回复突变试验》平板掺入法及相关文献2.3.1阳性物的致突变作用采用TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535为试验菌株,甲基磺酸甲酯、敌克松、叠氮钠、二氨基蒽、1,8-二羟蒽醌、2-氨基芴6种阳性物配制见表1,S9作为体外代谢活化系统。同时设溶剂对照,根据阳性物不同为水或二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)。将高压灭菌后的阳性物和经滤菌处理的阳性物分别掺入菌液并接种平板,观察2种阳性物的致突变作用。每个浓度做三皿平行,整个试验在相同条件下进行2次,结果为2次平均值。2.3.2阳性物的筛选采用TA97、TA98、TA100、TA102为试验菌株,S9作为体外代谢活化系统。将甲基磺酸甲酯、敌克松、1,8-二羟蒽醌、2-氨基芴4种阳性物按表1配制后等体积混合作为阳性物。设原液组、2倍、4倍、8倍稀释4个浓度组,同时设溶剂对照(根据阳性物不同为水或DMSO)、推荐阳性物组(同表1滤菌阳性物组)。将高压灭菌后的混合阳性物和经滤菌处理的混合阳性物分别掺入菌液并接种平板,观察2种阳性物的致突变效力。每个浓度做三皿平行,整个试验在相同条件下进行2次,结果为2次平均值。2.4模拟正常的实验环境以无致突变作用的玛咖片为基质3结果与分析3.1加热对不同阳性物的诱导突变作用根据GB15193.4-2014《食品安全国家标准细菌回复突变试验》判定受试物有致突变作用时,回变率要增加一倍以上,因此本文采用50%为结果判定标准;同时为了研究加热对致畸物的影响,将Ames试验中推荐的阳性物直接作为研究对象,按2.3.1方法进行实验,结果见表3。表3显示,所有菌的溶剂对照回变率均在自发回变范围内,不加热阳性物组的自发回变菌超过阳性物回变的最低值;证明本试验体系良好。加热后除二氨基蒽对TA1535加S9组的回变率有所增加为119%,其余阳性物的回变率均降低。其中最显著的为敌克松对TA98的回变率降为9.3%。整体来看,加热对阳性物的诱导突变作用影响较大,所有阳性物加热后回变率均降低,回变率降至50%以下的占60%。证明加热对致突变物的影响显著。从阳性物角度分析,受加热影响较大的为敌克松、2-氨基芴、甲基磺酸甲酯;而二氨基蒽和1.8-二羟基蒽醌2种阳性物热稳定性更好。从代谢活化角度分析,需活化(甲基磺酸甲酯、2-氨基芴)和不需活化(敌克松)不受其影响,没有明显区别。3.2加热对不同浓度混合阳性物的影响按2.3.2方法进行加热对不同浓度混合阳性物的影响实验,结果见表4。表4显示,所有菌的溶剂对照回变率均在自发回变范围内,推荐阳性物组的自发回变菌超过阳性物回变的最低值。加热后所有浓度混合阳性物的回变率均降低,稀释到4倍时,TA98加热后不加S9组降低至43.4%。稀释8倍时TA98不加S9回变率降低为46.1%,TA100加S9降低为49.1%。其余所有加热过的混合阳性物较不加热的回变率均降低,但降幅未超过50%。在实际情况中致畸物的污染很少会是单一物质,为了进一步研究加热对致畸物的影响。参照《保健食品检验与评价技术规范2003年版》采用推荐的4种阳性物用相应溶剂配制好后等体积混合,制作为模拟混合阳性物为研究对象,首先分析未加热情况下变化,结果见表5。不考虑浓度变化和加热,由表5可见混合阳性物原液较推荐阳性物对4个菌株的诱导效率均下降,其中TA100受影响最小。本实验中将4种阳性物等体积混合后平板掺入量依然为100μL/皿(与推荐阳性物的掺入量相同),等体积混合后相当于原匹配的阳性物减少为25%;75%为菌种和活化状态非针对性阳性物质。而Ames试验规范推荐的阳性物剂量、针对的菌种和活化状态均是经过专门筛选优化的,因此诱导效率下降是符合规律的。而TA100受影响小证明其较其他菌株对阳性物的选择性没有专一性。进一步分析浓度和加热的相互影响,结果见图1。结果显示:加热和不加热2种情况下4个菌株随混合阳性物浓度变化的趋势显著(图1a);即无论加热还是不加热,TA98的回变浓度曲线斜率是最大的,可见TA98对混合阳性物的浓度变化非常敏感,而其他3个菌受浓度影响较小。而图1b表明经过加热后所有浓度混合阳性物对所有菌的回变数值均降低,与推荐阳性物结果一致。但以降低至50%以下为标准时,混合阳性物原液为0组,稀释2倍为0组,稀释4倍为1组,稀释8倍为2组。加热对结果的影响随浓度降低而增加。从单个菌角度分析回变率与混合阳性物浓度呈正相关,不管加热不加热、加S9和不加S9,所有的回变率都随浓度降低而降低,同时具有良好的梯度关系。3.3加热对不同浓度混合阳性物的诱导效率为进一步模拟实际情况,在混合阳性物基础上制备模拟污染的保健食品为研究对象。选取1种以中药颗粒为主要组分的保健食品“玛咖片”作为基质,参照2003年版《保健食品检验与评价技术规范》将其配制为0.05g/mL水溶液作为基质。按表2配制混合阳性物到玛咖片溶液中,最终保证混合阳性物的浓度与2.3.1的混合阳性物完全相同,试验组设置与2.3.2相同。结果见表6。由表6可知:所有菌的溶剂对照回变率均在自发回变范围内,推荐阳性物组的自发回变菌超过阳性物回变的最低值。加热后所有浓度混合阳性物的回变率均降低。混合阳性物原液加热后:TA97、TA98、TA100、TA102不加S9及TA102加S9回变率均降低至50%以下;稀释2倍组加热后:TA97、TA98、TA100不加S9回变率均降低至50%以下;稀释4倍组加热后,TA97、TA98不加S9回变率均降低至50%以下。进一步对比未加热的混合阳性物原液与推荐阳性物回变率,结果见表7。表7结果显示:不考虑浓度变化和加热,混合阳性物原液较推荐阳性物对4个菌株的诱导效率均下降。与无基质的结果主要差异在于TA102受影响最小。进一步分析浓度和加热的相互影响,结果见图2。结果显示:加热和不加2种情况下4个菌株随混合阳性物浓度变化的趋势显著(图2a);即与无基质情况不完全相同,TA98加热组的加S9随浓度变化曲线依然陡峭,其他各组却趋于平缓。而图2b表明在基质中与前面推荐阳性物及混合阳性物的结果一致,经过加热后所有浓度混合阳性物对所有菌的回变数值均降低。但以降低至50%以下为标准时,趋势有所变化。混合阳性物原液有5组降至50%以下,稀释2倍为3组,稀释4倍为2组,稀释8倍为0组。与无基质的结果相反,加热对结果的影响随浓度降低而减少。与无基质情况相同,从单个菌角度来看,回变率与混合阳性物浓度是呈正相关的,不管加热不加热、加S9和不加S9所有的回变率都随浓度降低而降低,同时也具有良好的梯度关系。4加热对不同阳性物的影响目前未见针对保健食品中致畸物(致癌物)污染情况的相关调查研究。考虑到保健食品原料主要为中药材及可食用的天然植物食品原料,污染应主要来自中草药及天然植物原料种植时的土壤及水体污染,因此农残和环境污染应为重点来源。我国中药材农残问题近年呈上升趋势,2013年绿色和平组织发布的《药中药:中药材农药污染调查报告》中,对包括德国、法国、荷兰、加拿大、美国、意大利、英国在内的7个国家市场上产自中国的菊花、枸杞、金银花等常用中药材进行了抽样检测,结果发现,90%的样品中被检测出农残最终本研究选定Ames推荐阳性物作为研究对象。推荐阳性物中的敌克松是1958年由西德拜耳公司首先开发的产品,作为一种农药主要用于蔬菜病害的防治,呈红棕色、油状,其BOD/COD<0.19,很难降解本研究发现:基于Ames试验平板掺入法,3组实验结果均清楚地表明加热对阳性物诱变物的活力是有明显影响的。但这种影响在水或中药材颗粒基质中并不完全相同。水溶液体系中,推荐阳性物方案受加热影响诱导效率降至50%以下的占60%。当单一阳性物换为复杂混合阳性物时,诱导效率较标准推荐方案会大大下降,且在保健食品基质和水中的变化也有差异。其可能是中药颗粒对阳性物有吸附作用,其释放速递或与菌株的接触面积发生了改变导致。而浓度也是一个重要因素,在不同基质中混合阳性物表现出的诱导效率变化规律差异较大。水溶液中混合阳性物随浓度降低受加热的影响有增大趋势,但总的来讲影响较小,仅占所有考察情况的4种菌、4个浓度、加和不加S9共32种情况的(3/32)9.375%。而在以玛咖片为基质时(玛咖粉50%,山梨糖醇34.2%,牡蛎提取物9%、其他为赋形剂和添加剂)