大黄素型单酮遗传毒性致基因突变的体外pig-a和miniames试验研究

大黄素型单酮遗传毒性致基因突变的体外pig-a和miniames试验研究

茴香素含量很高，通常用于何首乌、人参等药物，随着药物储存时间的延长，其安全性受到广泛关注。不同蒽酮类化合物可在体内经不同代谢通路相互转化。课题组前期研究显示，二蒽酮及蒽酮糖苷类成分对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(bilirubinuridinediphosphateglucuronosyltransferase1A1,UGT1A1）有抑制作用，且空间暴露程度不同对其与UGT1A1酶的结合存在一定影响，导致不同程度肝毒性大黄素型单蒽酮化学结构（图1）。基于数据库文献报道的化合物毒性预测软件DerekNexus(Version6.0.1、LhasaLimited,UK）未能检索到其含有导致细菌突变的毒性警示结构，然而基于构效关系统计分析的化合物毒性预测软件SarahNexus(Version6.0.1、LhasaLimited,UK）则根据其含有的蒽环结构判断在体外试验系统中致突变性阳性的可能性为30%。本研究首次使用经典的细菌回复突变试验（Ames试验）和新兴的基于体外哺乳动物细胞的Pig-a基因突变试验，两种针对碱基突变风险的评价方法，对单蒽酮的遗传毒性风险作初步评价，为单蒽酮在药材中的定量、合理用药、有效监管提供参考。1材料表面1.1蘑菇和细胞本研究使用菌株为鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型（his小鼠淋巴瘤细胞L5178Ytk1.2试剂和机器1.2.1抑制剂的合成及功能性状主要包括大黄素型单蒽酮（中国医学科学院药物研究所杨建波博士赠送，纯度≥95%）；阴性对照二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）、阳性对照2-(2-呋喃基）-3-(5-硝基-2-呋喃基）丙烯酰胺（2-2-Furyl-3-5-Nitro-2-Furylacrylamide,AF-2,Sigma）、2-氨基蒽（2-Aminoanthracene,2-AA）、葡萄糖-6-磷酸（Glucose6-phosphate,G-6-P），烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠（NADPNa1.2.2荧光显微镜ix71,ofici流式细胞仪（FACSCalibur,BDbioscience）；高速冷冻离心机（Centrifuge5810R,Eppendorf）；倒置荧光显微镜（IX71,Olympu）；二氧化碳培养箱（HERAcellVIOS160i,ThermoFisher）；生物安全柜（NU-543-400S,Nuair）；恒温培养箱（MIR-253，三洋）；倒置显微镜（CKX31,Nikon）；免疫磁性分离架（QuadroMACSTMSeparator,Miltenyi）。2方法2.1细菌回复突变试验试验流程，底层琼脂、磷酸盐缓冲液、SEM顶层琼脂及S2.2试验用浓度的确定预试验对细胞毒性进行摸索，研究显示当单蒽酮浓度大于1.56µg/mL或作用时间大于4h时都呈现出较大的细胞毒性，出现严重的细胞死亡现象，故最终确定试验用浓度为（0.2µg/mL,0.39µg/mL,0.78µg/mL,1.56µg/mL），作用时间4h。将L5178Y细胞解冻复苏后置于完全培养基R10（含有10%马血清，1%青链霉素混合液，0.2mg/mL丙酮酸钠的RPMI1640）在37℃、5%CO非SS2.3pig-a突变检测取2×102.4处理数据2.4.1计算均值，标准差计数每孔中的回复菌落数量，每个浓度组分别求得均值，并以平均值±标准差表示。当试验组平均每孔中的回复菌落数≥溶媒对照组数值2～3倍，且存在量效关系时判断结果为阳性；反之为阴性。2.4.2数据处理组间突变率比较试验数据采用GraphpadPrism7(USA,GraphPadSoftware公司）进行数据统计，采用OneWayANOVA检验将各受试物处理组的突变率与溶媒对照组作比较，组间比较P<0.05视为差异存在统计学意义。3结果3.1细菌回复突变试验试验使用6种不同鼠伤寒沙门氏菌及1种大肠埃希氏菌开展基于6孔板培养的细菌回复突变试验，评价单蒽酮诱导细菌碱基突变风险。浓度为0.6～9µg/皿的单蒽酮在无及有S3.2皮g-a突变试验的结果3.2.1单环酮活性物质单蒽酮给药4h(-S4体肠灌流模型及筛选大黄素型单蒽酮母核结构与蒽醌结构相似，世界卫生组织国际癌症研究机构（InternationaAgencyforResearchonCancer,IARC）于2017年10月27日公布的致癌物清单初步整理参考，蒽醌在2B类致癌物清单中。提示蒽醌类结构具有较强的致癌风险，而蒽醌结构可在酸性环境中被还原，生成蒽酚及其互变异构体蒽酮。有研究报道采用体肠灌流模型Ames试验作为遗传毒性数据库（如Derek,Sarah）构建的基础以及新药研发初期先导化合物筛选的首选遗传毒性评价方法，是基于细菌体系评价物质致基因突变的最重要的试验方法之一，在药品、食品、化妆品、医疗器械等物质遗传毒性评价中均是组合必选试验之一。miniAmes是在标准平板基础上采用6孔板或24孔板代替10cm本研究在miniAmes试验前提下，开展体外Pig-a基因突变试验作为大黄素型单蒽酮体外遗传毒性评价的后续追踪试验，对Pig-a基因突变位点进行评价综上，本研究从Ames和体外哺乳动物小鼠淋巴瘤细胞L5178Y细胞开展大黄素型单蒽酮基因突变风险评价，提示大