灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因bckmo调控病菌致病力的机制

灰葡萄孢犬尿氨酸单氧酶基因bckmo调控病菌致病力的机制

0植物灰霉病灰葡萄素是导致植物灰霉菌的重要植物新品种，可归因于至少235种植物，给农业生产带来重大经济损失。1材料和方法1.1突变体的回复突变体bckmo灰葡萄孢野生型菌株BC22、BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183和BcKMO的回复突变体(BCG183/BcKMO)均由河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室提供。1.2ss-pcr法检测多聚半乳糖醛酸酶和其他基因型菌株的活性将野生型和突变体BCG183、BCG183/BcKMO定量接种到产酶的液体培养基中,于22℃黑暗培养10d。将培养液过滤后,8500r/min离心,获得的上清液即为粗酶液。在各粗酶液中加入硫酸铵至30%饱和度,4℃下静止过夜,4℃、8500r/min离心,弃上清液,用0.05mol·L采用DNS法测定各个菌株的多聚半乳糖醛酸酶(polymethylgalacturonase,PMG)、果胶酶(endopolygalacturonase,PG)和纤维素酶(cellulase,Cx)。按Hoffman方法测定多聚半乳糖醛酸反式消除酶(polygalacturonicacidtranseliminase,PGTE)和果胶甲基反式消除酶(pectinmethyltranseliminationenzyme,PMTE)的活性。以上试验均重复3次。1.3粗毒素的提取将野生型和突变体BCG183、BCG183/BcKMO分别定量接种到FriseIII培养基中,22℃黑暗静止培养21d。用乙酸乙酯对各菌株的培养滤液分别萃取3次,将萃取液经减压蒸发后用色谱甲醇定容,获得各菌株的粗毒素。将各菌株的粗毒素分别定量接种到刺伤的烟草叶片上,置于20℃恒温培养,根据接种叶片的发病情况,测定各菌株的毒素活性1.4培养条件对各菌株产酸能力的影响将野生型和突变体BCG183、BCG183/BcKMO分别接种于含0.05%(w/v)溴百里酚蓝的PDA培养基上和100mL的PD液体培养基中,22℃黑暗培养,通过观察培养基的颜色变化和测定培养液的pH值,确定各菌株的产酸能力。试验均重复3次。溴百里酚蓝起酸碱指示剂作用,培养基颜色呈黄色表示平皿中pH值下降,说明菌株能够分泌酸性物质。1.5病原菌穿透情况的测定制备同一生长时期的野生型和突变体BCG183、BCG183/BcKMO的菌丝悬浮液,将其分别接种到铺有洋葱表皮的PDA培养基上,培养2d后,移出病菌和洋葱表皮,并将移出的洋葱表皮进行台盼蓝染色,在光学显微镜下观察病菌的穿透情况;同时将培养皿放回培养箱中继续培养,通过观察培养基上的菌落生长情况确定菌株的穿透能力1.6相关基因的发现和突变根据已报道的灰葡萄孢致病相关基因腺苷酸环化酶编码基因Bac2结果2.1酶活性测定分别提取灰葡萄孢野生型BC22和突变体BCG183、BCG183/BcKMO的多聚半乳糖醛酸酶(PMG)、果胶酶(PG)、纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消除酶(PMTE),并测定其酶活性。结果发现,突变体BCG183中的PMG和PG的酶活性均较野生型和回复突变体BCG183/BcKMO明显增强,但Cx、PGTE和PMTE的酶活性与野生型和回复突变体没有明显差别(图1)。2.2突变体的毒素活性测定对灰葡萄孢野生型菌株BC22和突变体BCG183、BCG183/BcKMO的粗毒素进行生物活性测定,发现3个菌株的毒素均能在烟草叶片上产生致病斑,且突变体BCG183的病斑面积明显大于野生型和回复突变体(图2),表明突变体BCG183的毒素活性较强。2.3突变体培养基的颜色利用含有溴百里酚蓝指示剂的PDA培养基对野生型BC22和突变体BCG183、BCG183/BcKMO的产酸能力进行测定,发现野生型和BCG183/BcKMO突变体的培养基由原本的蓝紫色变成黄色,而突变体BCG183的培养基颜色没有明显的变化,说明突变体BCG183的产酸能力弱于野生型和回复突变体(图3-A)。检测野生型和突变体BCG183、BCG183/BcKMO的液体培养基的pH,结果发现,突变体BCG183的pH为5.83,而野生型和回复突变体的pH分别为5.62和5.41(图3-B),进一步说明突变体BCG183的产酸能力减弱。2.4突变体的穿透能力利用铺有洋葱表皮的PDA培养基对野生型BC22和突变体BCG183、BCG183/BcKMO的穿透能力进行检测,结果发现,野生型和突变体BCG183、BCG183/BcKMO均能穿透洋葱表皮,在培养基上产生菌落(图4-A)。将接种的洋葱表皮背面进行台盼蓝染色,均能发现病菌穿透、生长的菌丝(图4-B)。表明BcKMO突变不影响病菌的穿透能力。2.5致病相关基因的表达分析利用real-timePCR技术,检测野生型和突变体BCG183、BCG183/BcKMO中致病相关基因的表达情况,发现突变体BCG183中各致病相关基因的表达水平均明显高于野生型和回复突变体BCG183/BcKMO(图5)。表明BcKMO突变影响致病相关基因的表达。3灰葡萄孢在植物体的致病性灰葡萄孢的主要致病机制是产生多种致病因子,如降解和破坏植物细胞壁的胞壁降解酶类、毒害植物细胞的致病毒素类,参与信号识别及转导的物质、抵抗寄主防卫反应的酶类及小分子物质等文献报道,灰葡萄孢能够在植物体内和体外产生草酸文献报道,一些信号途径