异体猕猴桃间充质干细胞输注安全性评价

异体猕猴桃间充质干细胞输注安全性评价

间充质干细胞（msc）是一种具有多向分裂潜力的干旱性。易于分离和生长。在几代扩张之后，它仍然可以维持干燥的活性。可分为几种细胞，具有支持伤口愈合的能力和特殊的免疫功能，在血液重建、组织修复和基因治疗等领域具有广阔的临床应用前景。猕猴是与人最接近的非人灵长类之一,是研究移植的最好模型。本研究观察了猕猴骨髓来源MSCs的生物学特性,评价了异体MSCs输注的安全性和骨髓内存活情况,为以后的移植模型和临床应用奠定了基础。1材料和方法1.1动物合格号由中国军事医学科学院动物中心购进无关健康成年猕猴7只,年龄2~6岁,体质量2~8kg,雄性3只,雌性4只,动物合格证号SCXK-(军)2002-001。以雄性作为供者,雌性作为受者,雌雄配对(部分受者用同一雄性供者)。1.2细胞培养dmem速眠新0.1ml/kg肌注麻醉,每次从猴股骨穿刺抽取骨髓约5ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分层液(密度1.077g/ml)离心分离(400×g,30min),取白膜以上细胞部分,PBS洗2次,用DMEM/F12、40%MCDB-201、2%胎牛血清(GibcoBRL,美国)培养液,置37℃,5%CO1.3免疫组化检测细胞内良好品质用流式细胞术检测MSCs的细胞表型,简述如下:用直接免疫荧光法检测猕猴骨髓来源的MSCs的细胞表型。为检测细胞表面抗原,将第5代MSCs用胰酶消化后,用含0.5%牛血清白蛋白的PBS洗2次,加入鼠抗人CD29、CD33、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166单抗(BD公司),4℃孵育30min。为检测细胞内抗原Flk-1,将细胞用1%多聚甲醛4℃固定15min,并在室温下用0.1%的皂角素透膜1h,加入Flk-1单抗,4℃孵育30min。细胞用PBS洗2次,并悬浮在500μl的PBS中,选用同种同型非相关IgG抗体作为阴性对照,上流式细胞仪检测。1.4外部诱导分布当第3代细胞达80%融合时,以5×101.5mscs的输注猕猴分为2组:静脉输注组(2只)和骨髓内输注组(2只)。静脉输注组:将猕猴固定,选取上肢或下肢静脉建立静脉通路,输注生理盐水,将培养的MSCs过4号针尖(防止细胞团),从静脉输入(去除滤器),再用生理盐水冲管。骨髓内输注:将受体猕猴用速眠新0.05ml/kg肌注麻醉,从猴股骨下段穿刺,抽取骨髓约0.5ml,将重悬于0.5ml生理盐水的MSCs骨髓内注入,再注入0.5ml生理盐水,拔除骨穿针,局部压迫5min止血。1.6急性和慢性毒性反应及gv解码输注后观察心率、呼吸、血压、体温、皮疹、精神、大小便等,以后每周查血常规、肝肾功能,观察有无急、慢性毒性反应和GVHD表现。1.7外周血骨髓y特异性序列的检测异体输注后抽取1h、2h、4h、8h、24h、2d、7d、14d、28d、60d的外周血,1d、7d、14d、30d、60d的骨髓,检测Y特异性序列;7d、14d、30d、60d抽取骨髓(骨髓内输注组抽取注入侧和对侧股骨)约3ml,再次培养MSCs,检测Y特异性序列,参考文献2结果2.1mscs的生物学特性采用含2%FCS的DMEM/F12,40%MCDB-201培养液培养的猕猴骨髓单个核细胞,大部分细胞于24h内即贴壁,倒置显微镜下可见贴壁细胞呈圆形,有小的胞质突起72h后,大多数细胞有胞质突起,部分呈梭形,1周后以梭形细胞为主,胞质丰富,核大,核染色质细,核仁明显,细胞呈平行或漩涡状生长,见图1。猕猴的MSCs较人的稍粗短,连续传代10代形态无明显改变。将培养MSCs的上清液进行细菌、真菌培养,PCR检测支原体均为阴性。用流式细胞术检测培养第5代MSCs的细胞表型:MSCs特异性抗原高表达(Flk-1:73.71%,CD29:99.81%,CD105:84.0%,CD166:84.2%,CD44:30.66%),造血系抗原低表达(CD33:0.21%,CD34:0.08%,CD45:4.28%),见图2。MSCs向成骨分化过程中,细胞形态发生明显变化,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,形态近方形或多边形,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构,逐渐形成VonKossa阳性的骨结节。在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,胞质中逐渐出现脂肪滴,脂肪滴逐渐增大、增多,充满整个细胞胞质,油红O染色可见红色的脂肪颗粒,见图3。2.2急、慢性毒性反应及gvhd表现异体MSCs经静脉输注、髓内输注后,观察心率、呼吸、血压、体温、皮疹、精神、大小便等,随后观察2个月血常规、肝肾功能,均未见明显变化,未见急、慢性毒性反应和GVHD表现,注射局部未见红肿,下肢活动无障碍。2.3在异体灌溉条件下检测y的特异性序列异体静脉输注2例,细胞数分别为4×103mscs的特异性及其与gvhd的关系MSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞,在造血干细胞移植中,MSCs可增加造血细胞植入率、促进造血恢复、抑制免疫,防治GVHD,具有广阔的临床应用前景本研究用密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养的猕猴MSCs,形态为典型的成纤维细胞样,比人的MSCs稍短粗,细胞表型测定为高表达CD29、CD105、CD166、Flk-1等MSCs特异性标志,低表达CD33、CD34、CD45等造血细胞标志,与文献报道人的MSCs表型相似最近文献报道,MSCs表达MHC-Ⅰ类抗原,但仅表达极少量的MHC-Ⅱ和FasL,不表达共刺激因子B7-1、B7-2、CD40、CD40L等,因此,免疫原性弱,可跨越MHC屏障,MHC不相合的异体输注无毒