蛹虫草不同菌株生物学特性及栽培试验

蛹虫草不同菌株生物学特性及栽培试验

蠕虫虱子。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验中的蘑菇1.1.2培养基(1)PDA加富培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,蛋白胨3g,KH1.2方法1.2.1种子平板的制备将野生虫草子座用清水洗去表面浮土,置于75%乙醇中表面消毒2min,在无菌水中反复冲洗,放在无菌培养皿内备用。用无菌解剖刀将消毒后的虫草子座切成长度约1cm的小段,接种于PDA培养基的平板上。将接种后的平板放置在22~25℃的培养室中培养。平板略微倾斜放置。48~72h后菌丝萌发,选择无污染的菌丝,转接到新的PDA平板上进一步分离,最终得到纯化的虫草菌株。1.2.2社会学观察1.2.3培养基培养处理工艺将5个供试菌种分别接种于PDA培养基斜面上,22~25℃培养7~10d,待菌丝长满斜面。将活化后的斜面母种接入含有50mL液体培养基的三角瓶中,22~25℃震荡培养3~4d,菌丝长满液体表面。静置24h确保无杂菌后,转入500mL营养液中。将30g小麦和50mL自来水装入罐头瓶后用耐高温塑料膜扎紧,100℃常压灭菌8h,过夜冷却。取5mL液体菌种,以无菌操作接入瓶内小麦培养基上,18℃黑暗条件下培养7d。此阶段主要注意避光和低温。待菌丝长满培养基后,22℃光照转色。转色7d后在塑料膜上打孔1.2.4对分子的鉴定和系统发育的研究1.2.4.不同温度下ctab缓冲液的稳定性测定采用CTAB法取适量子实体样品置于研钵中,液氮冷冻研磨至粉末状。将样品粉末转移到含4mLCTAB缓冲液的灭菌离心管中,65℃下温育40min,每隔10min颠倒几次,使样品混匀。在通风橱内,加入4mL氯仿∶异戊醇(24∶1),轻微震荡混合20min。4℃离心10000r·min1.2.4.pcr反应u200450μLPCR扩增反应体系为:模板DNA1μL、10×PCRbuffer5μL、TaqDNA聚合酶0.8μL、dNTP(2.5mM)4μL、ITS4、ITS5(20μM)引物各1μL,用去离子水补至50μL。反应程序为:95℃预变性5min后,进入循环,94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min,共40个循环,于72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶,1×TAE为电泳缓冲液,5V·cm1.2.4.系统发育树的构建将所扩增出的5个供试菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列数据库,与Genbank中已经登录的序列进行Blastn比对,下载Score分值高的9株最相似菌株的ITS序列与供试菌株的序列进行系统发育树的构建。用ClustalX软件处理分析5个供试菌株的ITS序列,再用DNASTAR软件构建系统进化树,根据系统发育树探讨其亲缘关系。2结果与分析2.1不同菌株的气生引导基由图1可见,菌丝长满整个平板时,白化变异型菌株KB29的菌落颜色为纯白色,回复突变菌株KH29菌株为淡黄色;而其余3个菌株均为橘黄色。白化变异型菌株KB29和其回复突变菌株KH29的气生菌丝较为发达,基内菌丝相对较弱(表1)。5个供试菌株在固体培养基中的生长速度由快至慢依次为KB29、K17、KH29、K19和A2菌株,其中A2菌株需要约24d才能长满整个平板。2.2各菌株的生长特性由表2可见,K17菌株子实体长,粗细均匀,颜色橘黄,子囊壳丰富,出草整齐,每瓶干重达到4.67g,经济性状要明显优于其他4个供试菌株。其余依次为A2、K19、KH29和KB29菌株;A2菌株的干重虽然也达到4.66g,但子实体不光滑且扭曲,严重影响其外观性状;白化变异型菌株KB29的菌种活力有所退化,栽培产量较少,且子实体形态变异严重;回复突变菌株KH29子实体子囊头大,有毛刺,但子实体部分较细,不整齐,出草有橘黄色,也有少量白色;K19菌株颜色橘黄,子囊头也较大,出草整齐但子实体较细(图2)。2.3整株菌株的现实测序结果由图3可见,5个供试菌株的ITS扩增片段清晰,大小在500~750bp之间,且扩增结果稳定,重复性好,可以进行系统发育学研究。ITS序列测定结果表明(表3),5个菌株的ITS序列长度为545~566bp,GC含量为56.11%~57.06%。将所扩增出的5个供试菌株的ITS序列与Genbank中已经登录的序列进行Blastn比对,结果显示5株菌的ITS序列都为蛹虫草序列,同源性高达99%。该结果也说明,不同的蛹虫草菌株间的ITS序列是相对保守的。2.4供试菌株的遗传稳定性根据BLAST检索结果,下载Score分值高的9株最相似菌株的ITS序列与供试菌株的序列进行系统发育树的构建,由图4可见,14株菌聚成两个大簇,而供试的5个菌株均与蛹虫草聚在一起,支持了前面根据Blastn结果和ClustalX分析的初步鉴定结果。5个供试菌株的分类地位同属蛹虫草,它们的ITS序列的差异很小,属于种内差异。野生菌株A2、K19和K17与GU390585等3株蛹虫草的遗传距离要小于白化变异型菌株KB29和回复突变菌株KH29,这说明蛹虫草菌株产生白化变异后,菌株内的遗传物质发生变化。白化变异型菌株KB29与其他菌株的遗传距离相对较远,但与其回复突变菌株KH29遗传距离相对较小。这是否与其失去合成橘黄色色素的相关基因有关,还有待进一步研究。菌落、菌丝形态和产子实体能力相近并且都具备橘黄色或黄色色素的A2、K19和K17菌株,遗传距离也相对较小。遗传距离最为小的为A2和K17菌株。3系统发育学研究供试的5个虫草菌株,其中包括3个野生菌株A2、K17和K19,一个白化变异型菌株KB29和一个回复突变菌株KH29,它们在生物学特性上有一定差异。在栽培试验中,K17菌株的子实体性状最好,每瓶干重可达4.67g,是供试的5个菌株中最适宜人工栽培和开发的菌种。通过ITS序列测定和比对,5个菌株同属蛹虫草,且ITS序列遗传物质差异较小,属于种内差异。但不同菌株之间ITS序列的差异也有一定规律可循。通过系统发育树可以看出,ITS序列中遗传物质的差异和菌落、菌丝和子实体形态之间有正相关性,这符合了基因型决定表现型的遗传规律。在蛹虫草人工栽培生产中存在的主要问题就是菌种退化现象严重。菌种的退化问题在菌类栽培中普遍存在,而关于蛹虫草菌种退化有关的生理生化和遗传机制至今尚无明确的结论。由于ITS序列相对保守,适用于属内种间或种内群体的系统学研究。由于本研究收集到的5个菌株亲缘关系很近,在后续试验中应考虑采取其他分子生物学方法进行研究。在5个供试菌株中,白化变异型菌株KB29的菌丝体和子实体均为纯白色,如果性状能稳定遗传,有望在化妆品和保健品领域发挥巨大潜力。野生虫草菌株K17、K19和A2