sgl2选择性抑制剂筛选及药效学评价体系的建立

sgl2选择性抑制剂筛选及药效学评价体系的建立

糖尿病是一种慢性高血压。由于胰岛上存在绝对或相对不足的胰岛素分泌缺陷，它是一种代谢性疾病。2011年全世界约3.66亿糖尿病患者,预计到2030年将达到5.52亿近年来钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sodiumglucosecotransporter2,SGLT2)被认为是降糖药物开发的热门靶点之一,其SGLT2抑制剂(SGLT2inhibitor,SGLT2i)通过减少肾脏对葡萄糖的重吸收,促进尿糖排出从而降低血糖。与其他糖尿病治疗药物相比,SGLT2i独特的非胰岛素依赖的作用方式使其不受患者β细胞功能以及胰岛素敏感性的影响。同时,SGLT2i还具有减轻体重,降低内脏脂肪量,降低血压和降低血尿酸等优势选择性对SGLT2i研发是一个重要问题。肾脏每天滤过约180g葡萄糖,大部分被SGLTs重吸收目前SGLT2i研发通常采用同位素标记的葡萄糖类似物作为底物,其试剂成本高,易污染环境;荧光标记的2-脱氧葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxy-D-glucose,2-NBDG)转运效率较低,且不稳定。本研究的目的是建立SGLT2的选择性抑制剂筛选方法。在本实验室前期工作的基础上检测试剂及目的蛋白药品与试剂1-NBDG由药明康德新药开发有限公司合成(ET4099-7-P1);根皮苷(phloridzindihydrate,P3449)、氯化胆碱(cholinechloride)购于Sigma公司;达格列净由芷威(上海)化学科技有限公司(APIchem)合成。其他化学试剂购自国药集团化学试剂北京有限公司。pMSCVpuro(Clontech公司),TransT1感受态细胞(TransgenBiotech公司)核酸内切酶EcoRⅠ/XhoⅠ、T4DNA连接酶(Fermentas公司);琼脂糖(Sigma公司),DNAMarker(TransgenBiotech公司);质粒提取试剂盒、DNA转染试剂(Qiagen公司);BCA蛋白检测试剂盒(Thermo公司)。Cocktail蛋白酶抑制剂(Roche公司);anti-SGLT1(Abcam公司)、anti-SGLT2、anti-GAPDH(SantaCruz公司);HRP/FITC标记的二抗(中杉金桥公司);化学发光检测试剂(Tanon公司)。其他试剂为进口或国产分析纯试剂。荧光酶标仪(Enspire),激光共聚焦扫描显微镜(Bio-RadRadiance2100CLSM),凝胶成像分析系统(Tanon-4100),COHEK293(人胚胎肾上皮细胞)购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心;高糖DMEM、低糖DMEM培养基、胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司。细胞培养于高糖DMEM培养液中(含10%胎牛血清、50u·mL用于过表达的逆转录病毒载体为pMSCVpuro。设计引物通过PCR钓取人全长SGLT1cDNA(Forward:CCGCTCGAGGCCACCATGGACAGTAGCACCTGGAGC;Reverse:CCGGAATTCTCAGGCAAAATATGCATGGCAAAAG)。人全长SGLT2cDNA(NCBIReferenceSeqμence:NM_003041.3)由Invitrogen(上海)公司合成。将目的基因连接至pMSCVpuro载体并转化至感受态细胞TransT1。进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,并测序验证重组克隆中基因序列。进行稳定过表达SGLT1/SGLT2的HEK293细胞株的筛选:将测序正确的质粒转染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆细胞株,挑选单克隆扩增培养后,检测目的蛋白SGLT1/SGLT2的表达。提取细胞总蛋白。用BCA法测定样品蛋白的浓度。制备10%凝胶,上样量为10μg,电泳(80~120V,60~90min),转膜(320mA,60min)。2%BSA中室温封闭1h,加入一抗SGLT1(1∶1000)、SGLT2(1∶1000)、GAPDH(1∶2000),4℃孵育过夜,TBST洗膜后加入二抗(1∶5000),室温封闭2h,显影液孵育,凝胶成像分析系统进行显影。细胞爬片后,4℃PBS冲洗2遍,用4℃、2%多聚甲醛固定30min,加入PBS冲洗2次。加入甲醇置于-20℃脱水15min,4℃PBS中复水。用封闭液(2%FBS)进行非特异性位点封闭1h后,加入含有一抗(anti-SGLT2antibody,1∶50)的封闭液,4℃孵育1h,PBS冲洗3次。加入含有二抗(FITC-anti-goatantibody,1∶200)的封闭液,4℃孵育1h,PBS冲洗3次。10μg·mL24孔板用多聚赖氨酸预涂,干燥备用。细胞铺板,90%融合后,低糖无血清DMEM培养基处理2h,Na雄性ICR小鼠(22~24g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物合格证号:SCXK(京)2012-0001。将动物随机分为3组,每组8只:正常血糖组(NG)、dapagliflozin低剂量组(0.25mg·kg尾静脉注射四氧嘧啶(69mg·kg实验数据以ue0af±s表示,多组间比较采用one-wayANOVA(Prism5.0),两组间比较采用Student’st-test。P<0.05被认为存在统计学差异。结果1sglt1稳定过表达细胞构建分别采用RT-PCR、Westernblot对稳定过表达HEK293细胞中SGLT1表达进行检测,结果如图1所示,与pMSCVpuro-null转染组相比,pMSCVpuroSGLT1转染组SGLT1基因及蛋白水平均显著升高,说明SGLT1稳定过表达HEK293细胞构建成功。2sglt2蛋白表达双酶切鉴定结果如图2A所示,第一泳道为pMSCVpuro空载体;第二泳道质粒的电泳迁移率明显低于pMSCVpuro空载体,说明其分子质量大于空载体;第三泳道为pMSCVpuro空载体经XhoI和EcoRI双酶切;第四泳道为载体经XhoI和EcoRI双酶切后,在2000bp出现明显的条带,说明目的基因SGLT2已经插入载体。Westernblot检测稳转HEK293细胞中SGLT2蛋白表达情况。与pMSCVpuro-null转染组相比,pMSCVpuro-SGLT2转染组SGLT2蛋白高表达(图2B);细胞免疫荧光染色结果显示SGLT2蛋白表达于细胞膜及细胞质(图2C),说明SGLT2稳定过表达HEK293细胞构建成功。3ps-mscvpuro-gllt1细胞的荧光酶检测荧光显微镜下观察HEK293细胞对葡萄糖的摄取。如图3A所示,与pMSCVpuro-null转染组相比,pMSCVpuro-SGLT1、pMSCVpuro-SGLT2转染组细胞Na采用荧光酶标仪检测细胞裂解液的荧光强度,如图3B所示,SGLT1过表达细胞Na4选择性实验阳性药达格列净对SGLT1的半数抑制浓度(IC5一般药物效应的实验一次口服给予达格列净能够使正常血糖小鼠(NG)OGTT实验中血糖上升幅度降低(图5A),其中,高剂量组(4mg·kgsglti药效学评价选择性是评价SGLT2i类药物疗效及安全性的重要标准。SGLT2主要表达于肾脏,而SGLT1除了肾脏,还表达于肠、心脏、肝和肺中,对小肠中葡萄糖和半乳糖的重吸收具有重要作用目前,国内外常采用此外,本研究建立了整体水平的SGLTi药效评价方法。对阳性药达格列净进行降糖作用评价,发现其在正常小鼠中能够改善口服葡萄糖耐量;在高糖小鼠中,给药后1h即可降低餐后血糖,与文献报道一致本研究构建了SGLT1/SGLT2稳定过表达细胞模型,采用新的、较稳定的荧光脱氧葡萄糖1-NBDG作为示踪剂