气虚血瘀大鼠模型表征及血液流变学的动态观察

气虚血瘀大鼠模型表征及血液流变学的动态观察

气虚血瘀证是许多临床疾病中的常见症状，尤其是老年人神经疾病。中国已经进入老龄化社会，关于气虚血瘀证的研究已成为中医学领域的一个难题。多年来,学者们一方面结合中风病、冠心病、高血压等临床常见疾病从证类出现频率、证候特征与诊断、临床疗效评价等宏观角度对其进行了系统研究,初步建立了临床诊断与疗效评价方法。另一方面,从血液流变学、血管调控物质、组织形态改变等微观角度对其生物学基础做了有益探索,为科学阐明其生物学实质奠定了基础。临床研究中,经历数千年的整理与总结,中医证候学形成了一套以中医望、闻、问、切为基本信息采集方法的完备体系,这一体系经由临床反复验证,具有了较高的稳定性和科学性。与之相对,生物学基础研究多是基于不同疾病、不同造模方法和不同的微观指标进行的,缺乏与中医临床证候拟合程度衡量标准,造成其科学性和稳定性难以评价,成为困扰研究深入的一大难题。因此,探索生物学基础研究与临床证候研究的相关性及其评价方法成为当务之急。通过总结前人思路及方法,笔者提出了气虚血瘀证动物表征研究的新思路,并拟定了相关的表征体系。以此为依据,本实验结合“劳则气耗”中医理论,以力竭游泳为主要造模手段,造成气虚血瘀大鼠模型,在此基础上,根据自拟表征体系进行动态观察,检测模型大鼠相关血液流变学指标变化,探索证候生物学基础及动物模型研究的客观评价方法。1材料和方法1.1实验动物的饲养健康成年雄性SD大鼠60只,体质量(200±10)g,由维通利华实验动物研究所提供。于实验前1周购进实验动物,安静环境分笼饲养,温度控制在(25±1)℃,相对湿度为60%,自由摄入水食。随机分成正常组、模型组,30只/组。每组大鼠分别再分成1周、2周、4周组,10只/组,同时点两组间相互对照。1.2适应游泳环境模型组大鼠于造模前1周进行游泳训练,隔日1次,2~3min/次,使之适应游泳环境。实验过程中,正常组给予普通饲料进食,模型组给予普通饲料加力竭游泳造模,每周第1~5天进行力竭游泳造模,建立气虚血瘀大鼠模型,力竭标准控制为大鼠沉入水中10s不能自行浮出水面。1.3实验大鼠一般情况及电生理指标检测模型组及正常组以力竭游泳的最后1周为检测周,集中进行相关表征及血液流变学检测。于每周星期一、星期四两天观察皮毛色泽、爪甲颜色、精神状态等一般状况。同时测量大鼠体质量、平均进食量变化。造模期间记录大鼠每天游泳时间,计算各周的平均游泳时间。水迷宫实验采用DMS-3Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。旷场分析于检测周第6天进行,记录中央格停留时间、水平运动次数、垂直运动次数等数据。检测周第7天对大鼠麻醉状态下进行舌质评分,评分标准自拟,同时拍摄舌图,采用富士数码照相机(FinePixS9500,900万像素)。复合电生理检测采用BIOPAC-MP150型16导联多功能电生理仪,分别检测心率、呼吸频率、大鼠前肢末端皮肤温度。通过以上表征检测,尝试较为全面反映大鼠气虚血瘀状态。1.5统计学处理对相关数据使用SPSS11.5软件进行统计学处理,计数资料采用t检验,等级资料采用单因素方差分析,血液流变学指标采用单因素方差分析,实验结果以均数±标准差2气虚血瘀模型与大鼠相关2.1单次力竭大鼠的反应单次力竭指在造模过程中,模型大鼠单次游泳所要达到的力竭标准及其表现。单次力竭后大鼠表现为目光呆滞,呼吸喘促,左右摇晃,无摇头甩水现象,无力反抗、理毛,站立不稳,一触即倒,见图1。单次游泳均使大鼠达到力竭,保证了造成气虚的施加因素持续存在。2.2慢性疲劳慢性力竭指模型大鼠在经过多次力竭游泳后,表现出较为稳定、能够一定程度反映证候特征的宏观表征,主要包括以下方面。2.2.1气虚的表现经过长期的力竭游泳后均表现出精神状态差、活动减少、体质量下降、运动能力差、懒动等气虚相关表征。2.2.1.运动轨迹型健康大鼠表现灵活,眼光有神,反应迅速,被毛光泽,爪甲红润光泽。力竭游泳造模后大鼠无精打采,眼微睁无神,自主活动少,对外界反应迟钝,被毛黯淡枯燥,爪甲色淡。与气虚证机体失养、神疲症状相对应。2.2.1.不同密度的耦合数据正常组分别为28.4、26.3、25.1g,模型组分别为27.5、28.6、28.4g,见图2。可见正常组大鼠进食量逐渐下降,与之相对,模型组大鼠进食量有所增加,可能与大鼠的力竭游泳导致能量消耗增加有关。2.2.1.体质量和指数模型组大鼠体质量增长缓慢,抓挠动作少、动作迟缓,2周、4周的体质量均低于正常组,P<0.05,见表1。与气虚证形体瘦弱症状相对应。2.2.1.造模时间对大鼠运动能力的影响模型组大鼠1周、2周、4周的平均游泳时间分别为(50.45±32.02)min,(27.91±16.86)min,(32.80±32.67)min。2周比1周时明显缩短,4周时于2周时接近,可见随造模时间延长,其游泳时间有缩短的趋势,见图3,反映了力竭游泳2周后大鼠运动能力降低。与气虚证乏力症状相对应,乏力为人体主观感觉,大鼠运动能力的降低为大鼠疲乏状态的反映。2.2.1.5个概率分析2.2.1.水迷对大鼠定位航道和空间搜索的影响Morris水迷宫为反映大鼠空间记忆的常用实验之一。在本实验中模型组大鼠在水迷宫常见定位航道和空间搜索两项指标中与正常组比较未见明显差异(P>0.05),见表2。可以认为,模型大鼠整体气虚血瘀状态可不表现出认知功能损害。2.2.2血液抑郁症的迹象2.2.2.两组舌质评分比较模型组大鼠自游泳1周末,舌质开始由淡红而见明显紫黯,舌质评分较正常组增高,其差异有显著性(P<0.05)。其分值随游泳时间延长逐渐增高,见表1。舌图照相也与之相应。2.2.2.2舌画3血液流变学结果3.1全血黏度测定血黏度方面,模型组2周末血浆黏度增高(P<0.05),全血黏度未见有显著差异。见表3。说明经过力竭游泳2周,可能引起血浆成分的变化。3.2数在力竭游泳后出现降低趋势红细变形性方面各组均未见明显变化。红细胞聚集指数在力竭游泳后出现了降低趋势,见表3。其中1周、2周末较正常组为低,差异显著(P<0.05),4周末结果增高,但差异无显著性。3.3血液大气压aptt凝血相关指标方面,模型组PT1周、2周(P<0.01)、4周(P<0.05)末时缩短,较正常组差异显著。APTT在4周末时明显缩短,差异显著(P<0.01)。反映了模型大鼠血液存在高凝状态。FIB含量1周末时较正常组有所增高,但差异无显著性,2周末时接近于正常组,4周末时较正常组反而有所降低,差异显著(P<0.05),见表3。4血液流变学指标检测临床应用特点是临床研究的重要发现动物模型研究为气虚血瘀证生物学基础研究的重要手段,主要包括结合病因造模、病理模拟造模及病证结合造模等不同方法结果显示模型大鼠在力竭游泳后,表现出精神状态差、体质量下降、游泳时间缩短、旷场分析中央格时间延长、短暂的排便增多等,分别与气虚证的倦怠、消瘦、乏力、懒动、便溏等证候特征相应,因此可以作为反映气虚的敏感表征。而舌质紫黯则为反映血瘀的敏感表征,这一点与临床研究中人体特征相一致。以上表征的确立,同时证明以力竭游泳为造模手段造成气虚血瘀的动物模型是科学可行的。血液流变学指标主要包括血黏度、红细胞变形性、红细胞聚集性、红细胞压积、血小板聚集性、血小板黏附性、凝血因子、血浆纤维蛋白等,概括起来有浓、黏、凝、聚几个主要方面。临床上,血液流变学改变为血瘀证研究的重要指标,以往研究中,血瘀证血液流变学特征主要包括血液黏度增高、血小板黏附率增高、凝血时间缩短、纤维蛋白原含量增高等。1986年第2届全国活血化瘀研究学术会议,将血液流变学指标的变化列为血瘀证的诊断标准之一既往有关气虚血瘀证的血液流变学特征研究多集中在临床方面,以人体疾病状态下的血液流变学变化为主要研究对象,其结果多与血瘀证相类。而对动物模型血液流变学变化缺乏系统研究和成熟理论观点。本研究中模型大鼠力竭游泳后血液流变学改变突出的表现为凝血指标的异常,包括PT、APTT值的降低,另外还包括血浆黏度降低,红细胞聚集指数及纤维蛋白原降低等。这一结果与临床研究不完全一致,部分指标支持了血瘀的存在,部分指标虽有变化,但波动较大。考虑动物模型模拟的仅为气虚血瘀状态,不表现为具体的疾病,因此这一特征是否为本动物模型所特有,有待于进一步实验结果的验证。1.4全血黏度、低血压、蛋白、响应面模型大鼠的理化指标检测于1周、2周、4周末分别取正常组及模型组大鼠各10只,使用10%水合氯醛按照3.5mL/kg体质量的比例腹腔注射麻醉,腹主动脉取血检测血液流变学指标。采用肝素抗凝管取血3mL,检测全血黏稠度、血浆黏度及红细胞变形、聚集指数。采枸橼酸钠抗凝管取血3mL,离心后分别取上清检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原含量(FIB)。全血黏度及血浆黏度采用普利生全自动自清洗血流变仪LBY-N6B及微量血浆测试装置(锥板法)检测。红细胞变性聚集采用普利生LDY-DX3红细胞变形仪检测。血凝指标采用普利生C2000-2型高性能血凝仪(磁珠法)检测。离心使用EpendorfCentrifuge5810R高速冷冻离心机。模型组大鼠中央格停留时间,2、4周时较正常组有所延长(P<0.05),见表1,反映了模型大鼠的胆怯和懒动状态。水平运动、垂