DNA提取与鉴定专业知识讲座

试验指导老师刘晓颖张萍萍陈彦王剑峰李绍飞

2023-02生物化学大试验第1页生物化学大试验试验一：动物基因组制备及其判定1试验二：动物基因组制备及其判定2试验三：动物基因组制备及其判定3试验四：糖类化合物提取及TLC分析1试验五：糖类化合物提取及TLC分析2试验六：Sephadex-G50层析法分离蛋白质试验七：SDS测定蛋白质分子量试验八：聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质等电点第2页生物化学大试验试验一：动物基因组制备及其判定1试验二：动物基因组制备及其判定2试验三：动物基因组制备及其判定3试验四：糖分离判定—硅胶G薄层层析试验五：Sephadex-G50层析法分离蛋白质试验六：蛋白质FPLC分离与定量测定第3页试验要求（1）试验前要预习有关内容，弄懂原理，理解试验设计思绪，找出试验操作关键步骤，试剂配制办法及用量，数据处理办法等。（2）试验过程中，要认真，规范操作。学会安排试验时间和试验次序。如实统计试验中出现现象和数据。（3）使用仪器时要按照说明书去做。发觉故障应停顿使用。节省试剂。公用试剂用完后，要及时放回原处。（4）试验报告要及时完成。报告上要注明试验日期及温度。在报告成果讨中，对试验现象，成果和数据等可进行分析；也可对试验中遇到问题及试验中需要改善地方进行讨论。（5）一般试剂都应用蒸馏水或无离子水(即离子交换水)配制，有特殊要求除外。（6）试剂(尤其是液体)一经取出，不得放回原瓶，以免因量器或药勺不清洁而沾污整瓶试剂。取固体试剂时，必须使用洁净干燥药勺。（7）使用易燃、易爆、有腐蚀性甚至有毒化学药品时应注意安全，必要时应戴手套，带口罩或防毒面罩，并在通风橱中进行。（8）试验纪律：不迟到和缺席。试验室卫生要轮流值日。第4页成绩评定平时成绩：考勤试验技能测试和试验报告等70～60%期末理论考试：30～40%第5页动物组织ＤＮＡ提取与判定刘晓颖张萍萍第6页分离纯化核酸标准与要求1.应确保核酸一级构造完整性完整一级构造是确保核酸构造与功能研究最基本要求)

2.排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子污染

纯化核酸样品不应存在对酶有抑制作用有机溶剂或过高浓度金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子污染应减少到最低程度；无其他核酸分子污染，例如提取DNA分子时，应清除RNA分子3.减少化学原因对核酸降解

避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键破坏，操作多在pH4～10条件下进行第7页4.减少物理原因对核酸降解

强烈振荡、搅拌，将细胞突置于低渗液中，细胞裂解、反复冻贮等造成机械剪切力以及高温煮沸等条件都能显著破坏大分子量线性DNA分子．对于分子量小环状质粒DNA及RNA分子，威胁相对小某些。5.避免核酸生物降解

细胞内、外多种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸一级构造。DNA酶需要Mg2+，Ca2+激活，因此试验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐，可基本抑制DNA酶活性

RNA酶不但分布广泛，极易污染，并且耐高温、耐酸碱，不易失去活性，因此生物降解是RNA提取过程主要危害原因。进行核酸分离时最佳用新鲜生物组织或细胞样品，若不能立即进行提取，应将材料贮存于液氮或一70℃冰箱中。第8页DNA在细胞内分布核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都以与蛋白质结合状态存在。真核生物染色体DNA为双链线性分子，原核生物染色体DNA、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA为单链环状分子；第9页95％真核生物DNA主要存在于细胞核内，其他5％为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等RNA分子主要存在于细胞质中，约占75％，另有10％在细胞核中，15％在细胞器中。大多数生物体内RNA分子均为单链线性分子并具有不一样构造特点，如真核生物mRNA分子多数在3＇端带有polyA构造。

第10页DNA性质

DNA是很惰性化学物质，双链由氢键紧密相连，其碱基对外侧受磷酸和糖保护，并由于其内部碱基堆积力而深入加强，使DNA在细胞内比其他成份更具化学耐久性。因此在氯仿等使蛋白质变性条件下，DNA分子仍然稳定。真核生物中染色体DNA与碱性蛋白(组蛋白)结合而成核蛋白(DNP)形式而存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液(1-2mol/L氯化钠)，但不溶于生理盐溶液中(0.14mol/L氯化钠)，而RNP此时溶解度较大，因此可利用这一性质，将DNP与RNP分离。

DNA在乙醇中形成絮状沉淀，使DNA最后得以分离第11页真核生物基因组DNA分离纯化基本步骤真核生物一切有核细胞(包括培养细胞)都能够用来制备基因组DNA。提取办法包括两步：

1、先温和裂解细胞及溶解DNP，而后使DNP与RNP分离，再使核蛋白解离，释放出DNA.

真核细胞破碎有多种伎俩，包括超声波破碎法、匀浆法、液氮破碎法、低渗法等物理办法及蛋白酶K和去污剂温和处理法，为取得大分子质量DNA，一般多采取后者温和裂解细胞。第12页高分子质量DNA在物理上仍是易碎，在溶液中，长而弯曲DNA分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸基团间静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引发流体剪切力作用而断裂，因此，基因组DNA容易成片断获取，但所需分子质量越大，取得难度也对应增加，大于150kbDNA分子在常规分离办法中多被切断。清除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80％甲酰胺解聚核蛋白联合透析办法，可得不大于200kbDNA片段。2.采取化学或酶学办法清除蛋白质、RNA及其他大分子第13页猪脾脏DNA提取与判定【试验目标】掌握浓盐法提取与判定动物组织DNA原理和办法。第14页【试验原理】核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。因此核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。在细胞内，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（RNP），DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（DNP）。在０.14mol／L氯化钠溶液中，RNP溶解度相称大，而DNP溶解度仅为在水中溶解度1％；当氯化钠浓度达成1mol／L时候，RNP溶解度小，而DNP溶解度比在水中溶解度大2倍。因此常选用０.14mol／L氯化钠溶液提取RNP，而选用1－２mol／L氯化钠溶液提取DNP。第15页

核酸提取液中具有蛋白质、多糖等能够用沉淀分离法除去。在核酸提取液中加入氯仿-异戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿一水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。第16页核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中加入亲水有机溶剂（乙醇），使DNA或RNA呈絮状沉淀析出。第17页【试验材料】1．材料新鲜(冰冻)猪脾脏。2．器材高速组织捣碎机，恒温水浴，台式冷冻离心机，锥形瓶，具塞三角瓶，试管3．试剂(2人/组)(1)0.1mol/LNaCI-0.05mol/L柠檬酸钠混合液：称取0.58gNaCl和1.47g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后稀释至100mL。(2)10％(1.71mol/L)NaCl溶液200ml(3)氯仿:异戊醇(24:l,V/V)，现用现配（通风橱中）。(4)95％乙醇

第18页【试验办法】1．取新鲜(冰冻)猪脾脏20g，剔去结缔组织，用0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸溶液冲洗除去血水，在冰浴上剪成碎末。2．加入2倍组织重0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠混合液(40mL)置高速组织捣碎机内破碎细胞膜(慢档，每次5s，间隔30s，共绞3次)，取得组织浆液。静置5min，期间轻轻搅拌以充足释放RNA。3．组织浆液于4℃3500r/min离心20min，弃去上层液，搜集沉淀(包括细胞核)。4．向细胞核沉淀中加入6倍组织重10％(1.71mol/L)NaCl溶液120mL，充足搅匀，置冰箱内过夜。第19页【试验办法】5．次日将所得到半透明粘稠状液体连续注入(线状、迟缓倒入)预冷11倍体积(1320mL)蒸馏水中，轻轻摇匀，DNP即呈絮状沉淀析出，置冰箱内放置数小时。6．上层清液利用虹吸办法吸出，剩下具有沉淀少许溶液经离心(3500r/min，15min)，搜集DNP沉淀。7．将DNP沉淀再溶于原组织重约4倍体积(80mL)10％NaCl溶液中，轻轻搅拌加速溶解，转移至带盖三角瓶中。第20页8．加入l/2体积氯仿-异戊醇溶液(24:l,V/V)40mL，上下剧烈振荡2-5min

，使组蛋白分离，于3500r/min，离心l5min，吸出上面具有DNA和DNP水层，弃去两层间变性蛋白凝胶，回收下层有机相。9．上层水相再次加入20mL氯仿-异戊醇混合液，继续抽提清除蛋白，数次反复此操作（最少共3次）直至两相之间无显著变性蛋白质凝胶生成。【试验办法】第21页10．最后吸出上清液并将它连续注入两倍体积预冷至4℃95％乙醇中。11．用玻棒小心捞出纤维状DNA钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用80％和95％乙醇洗涤，最后用少许无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽可能吸尽乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维DNA钠盐。【试验办法】第22页【注意事项】1．为了避免大分子核酸在提取过程中被降解，使其分子断裂，因而不能取得天然大分子核酸。提取中需要加人柠檬酸钠、EDTA、8-羟基喹啉等抑制核酸酶活力，并在低温下进行操作，另外提取过程中应避免加热，强酸，强碱和剧烈振荡等。本试验第一步进行组织匀浆时，不宜过于剧烈，时间不能太长，避免部分细胞核被破坏，造成DNA释放而被断裂，这将关系到最后是否能取得纤维状DNA。第23页2．除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分DNA断裂，乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上纤维状DNA外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂DNA。但若振荡不够，蛋白质不能较好除去，则影响DNA制品质量。3．细胞核沉淀加入浓盐溶液，冰箱放置过夜后，有时也许形成块状凝胶(如以脾脏为材料制备DNA)，应置捣碎机内绞5s，打坏凝胶块，但此时DNA已从核内溶解出来，因此不宜剧烈打坏。【注意事项】第24页思考题1.为何在低温下进行？2.加柠檬酸钠和EDTA作用?3.加NaCl作用，为何要加到1mol/L?4.加入异戊醇有什么作用？5.分离纯化过程中每一步试剂作用？第25页试验室：315室313室311室领用仪器：312室王剑峰纯水机：311室制冰机室：204室离心机：313室一台，204室一台，103室一台，101室一台，分光光度计室：206室第26页DNA判定与分析二苯胺显色法测定DNA含量紫外吸取法测定DNA纯度琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子大小与完整性第27页二苯胺显色法测定DNA含量（一）强酸、加热条件下，能够使DNA中嘌呤碱基与脱氧核糖间糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。

其中2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω―羟基―γ―酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸取。DNA在40-400μg/ml范围内光密度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少许乙醛可提升敏捷度，并且其他化合物干扰也显著减少。当样品含少许RNA时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成多种有色物质，干扰测定。【试验原理】第28页1、DNA标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准DNA以0.01mol/LNaOH配成200微克/毫升标准液。每组需12.4ml，200ml/班2、待测样品液：精确称取猪脾DNA5mg,用0.01mol/L氢氧化钠溶液定容至50ml配成100微克/毫升溶液。每组需7ml3、二苯胺试剂：1g二苯胺（需在70%乙醇试剂中重结晶2次)+100mL冰乙酸+10mL过氯酸，混合备用，临用前加入1.0mL1.6%乙醛。每组需64ml,1000ml/班4、1.6%乙醛：取47%乙醛3.4ml，加重蒸水定容至100ml（放于冰箱中，一周之内能够使用）。注意：商品用有47%和40%两种

第29页

1.DNA标准曲线制定：取14支试管，提成2组，依次加入0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于沸水浴中加热10min，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸取值为纵坐标，绘制标准曲线。

【操作办法】第30页

1

2

3

4

5

6

7

DNA含量/μg

0

40

80

160

240

320400

DNA标准溶液／mL

0

0.2

0.4

0.8

1.21.6

2.0蒸馏水／mL2.01.81.6

1.2

0.8

0.4

0二苯胺试剂／mL

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0

4.0混匀，立即放入沸水浴中加热10min，取出后流水冷却，冷却后595nm处比色

A595

DNA标准曲线制定以1号管为空白对照第31页2.制品测定：

取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线制作。3.

根据测得光吸取值，从标准曲线待测上查出对应当光吸取值DNA含量，计算出制品中百分含量。【操作办法】第32页

DNA纯度：待测液中测得核酸微克数

DNA%=×100待测液中制品微克数DNA产率:测得DNA微克数

DNA%=×100原料微克数数据处理第33页二苯胺试剂仅能与嘌呤核苷酸中脱氧核糖反应.因此测定可靠性受到不一样起源DNA中嘌呤与嘧啶核苷酸百分比变化限制，为提升测定精确度，应使用经纯化其含磷量已知小牛胸腺DNA作为标准样品进行校正。【注意事项】第34页

紫外吸取法测定DNA纯度（二）

核酸在260nm波长处具有紫外吸取特性(最大吸取峰)。此法迅速、简便，且不破坏样品，是定量测定浓度较高纯DNA和RNA溶液首选办法。

高纯度DNA制品260nm与280nm吸光值在1.8左右，当比值偏高时表白制品中混杂有RNA,而比值偏低时则表白制品中也许有蛋白质或酚污染。因此，可利用A260/A280比值测定来判定DNA制品纯度。【试验原理】第35页1．吸取2.5mlDNA样品，转入石英比色杯中(若样品很少，可用0.5mL比色杯，上述体积均减二分之一)。2．用2.5mL0.01mol/LNaOH校正紫外分光光度计零点。3．在260nm，280nm处罚别读出吸光度值(A)。定量分析：DNA浓度=A260×核酸稀释倍数×50／1000=A260×1×50／1000=20×A260(μg/μl)RNA浓度=A260×核酸稀释倍数×40／1000(μg/μl)【试验步骤】分光光度换算：

1A260双链DNA=50μg/ml

1A260单链DNA=30μg/ml

1A260单链RNA=40μg/ml

第36页注意将DNA样品稀释到A280在0.2-0.8（0.1-1.0）之间再测A260、A280及计算A260/A280比值，由于只有在此范围内才有线性关系，可先用原液测定，再估算稀释百分比。第37页4．纯度分析：若为DNA纯品，则A260／A280=1.8

若为RNA纯品，则A260／A280=2.0

若DNA样品A260／A280>1.8，说明仍有RNA，可用RNA酶处理样品；若A260／A280<l.7，说明样品中存在蛋白质，应再用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化DNA。若为RNA样品A260／A280<2.0，也应考虑再用酚/氯仿抽提。若核酸样品A260／A230<2.0，考虑有盐未除尽。用A260／A280比值估计核酸纯度仅在制备物中没有酚时才精确，因水饱和酚在270nm波长处有特性性吸取峰，其A260／A280比值也为2.0。无酚核酸制品A260／A270比值约为1.2。【试验步骤】第38页

琼脂糖凝胶电泳检测DNA（三）

DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子大小及构象差异而展现迁移位置上差异，对于线形DNA分子，其电场中迁移率与其分子量对数值成反比。电泳时加溴化乙锭(EB)，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254～365nm紫外线照射下可产生橘红色荧光，可用于检测DNA。【试验原理】第39页1．试验器材电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像系统2．试剂(1)5×TBE缓冲液(pH8.3)：54gTris碱，27.5g硼酸，20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加水至1L。(2)0.5×TBE缓冲液(pH8.3)。(3)溴化乙锭(EB)(10mg/mL)。(4)0.8％琼脂糖凝胶：琼脂糖0.8g加至100mL0.5×TBE缓冲液，加热熔解备用。(5)6×凝胶上样缓冲液：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，30％甘油溶于水中，于4℃保存。(6)DNA分子量标准Marker。【试验材料】第40页常用电泳缓冲液

缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×：0.04mol/LTris-乙酸50×：242gTris碱

0.001mol/LEDTA57.1ml冰乙酸

100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/LTris-磷酸10×:10gTris碱

0.002mol/LEDTA15.5ml85%磷酸（1.679g/ml）

40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.5×0.045mol/LTris-硼酸5×：54gTris碱

0.001mol/LEDTA27.5g硼酸

20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1×:50mmol/LNaOH1×:5ml10mol/LNaOH

1mmol/LEDTA2ml0.5mmol/LEDTA(pH8.0)Tris-甘氨酸c1×:25mmol/LTris5×:15.1gTris

250mmol/L甘氨酸94g苷氨酸（电泳级）（pH8.3）

0.1%SDS50ml10%SDS(电泳级)第41页

凝胶加样缓冲液缓冲液类型6×缓冲液贮存温度I0.25%(ol/V)溴酚蓝4℃0.25%(m/v)二甲苯青FF40%(m/v)蔗糖水溶液Ⅱ0.25%(m/v)澳酚蓝室温0.25%(m/v)二甲苯青FF15%(m/v)聚糖体(Ficoll)(400型，Pharmacia)水溶液Ⅲ0.25%(m/v)溴酚蓝4℃0.25%(m/v)二甲苯青FF30%甘油水溶液Ⅳ0.25%(m/v)溴酚蓝4℃40%(m/v)蔗糖水溶液第42页使用凝胶上样缓冲液目标增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品展现颜色，从而使加样操作更为便利，具有在电块中能以可预知速率向阳极泳动染料。第43页1．琼脂糖凝胶板制备：将0.8％琼脂糖凝胶加热熔化均匀，冷却到60～70℃加EB至终浓度0.5μg/mL，倒入封好凝胶槽，厚度约3～5mm，在距底板0.5～1mm位置放置样品梳，检查梳子齿间有没有气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放人水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1～2mm为止。【试验步骤】第44页【试验步骤】2．加样：样品中加1/5体积6×凝胶上样缓冲液，混匀，取10～15μl加入凝胶点样孔中。同步要设置合适DNA分子量标准物。第45页

Marker样品DNA1样品DNA2加样量ul610106×LoadingBuffer022第46页3．电泳：电压2～10V/cm胶，待溴酚蓝移至凝胶2/3距离时，关闭电源。4．观测：取出凝胶块，置凝胶成像分析仪上观测，即可见橘红色DNA区带。【试验步骤】第47页溴酚蓝在琼脂糖中移动速率约为二甲苯青FF2.2倍，而与琼脂糖浓度无关;以0.5