银杏叶提取物中总黄酮的含量测定

银杏叶提取物中总黄酮的含量测定

银杏是一种古老的遗迹植物，其疗效最初记录在《神农本草经》中。对润肥、哮喘、止咳等疾病也有治疗作用。系为银杏科银杏属植物,又名公孙树,为我国特有树种。银杏叶为银杏的干燥叶,其提取物中主要含有黄酮类化合物和二萜类化合物,它们具有改善心脑血管循环、抑制血小板凝聚酶、抗菌、抗病毒、抗癌等作用文献中有采用紫外可见分光光度法1、材料和机器1.1、合成药物银杏叶(河南省银杏科学技术开发中心提供);银杏叶提取物(河南鲁山县银杏叶提取厂和本实验室提供);DM130树脂(山东齐鲁抗生素厂);芦丁、槲皮素(中国药品生物制品检定所);山柰酚、异鼠李素(Sigma公司);甲醇、乙醇、丙酮(为工业原料或分析纯);其它试剂均为分析纯。1.2、水质、设备以及泵系统UV-4600型紫外可见分光光度计(瑞典Pharmacia公司);高效液相色谱仪,配备有600E型泵系统,966型二极管阵列检测器,RCMC18(8.0×1.0cm,粒度:5μm)径向加压柱(美国Waters公司);树脂柱(有机玻璃柱,高55cm,上端直径11cm,下端直径8cm);CL-25型蠕动泵(北京宣武超滤设备厂);PTGCPrep超滤柱(美国Milipore公司)。2、方法和结果2.1、银杏叶提取物的制备2.2、提取物的制备方法:取200g干银杏叶粉碎,浸泡在2000ml70%乙醇中,在水浴上加热回流提取2次,每次各3小时,过滤,2次滤液合并,在水浴上减压蒸馏,除去溶剂,用石油醚脱脂2次水溶液浓缩至原体积的1/10,后用20%乙醇悬浮,过滤,滤液中加入少量的硼砂,在水浴上减压蒸馏,回收乙醇,水液在水浴上浓缩成浆液状,控制在60℃温度下真空干燥,得提取物29.35g。2.2.1分光光度法2.2.1.容量瓶的制备标准液的配制:精密称取芦丁对照品23mg,置于100ml容量瓶中,用30%乙醇溶解,定容,备用。标准曲线的制作:分别精密吸取上述芦丁的标准液0.5、1、2、3、4ml各置于10ml容量瓶中,加30%乙醇5ml、5%NaNO2.2.1.2.测量条件的选择以芦丁为对照品,取银杏叶提取物约0.02g置于10ml量瓶中,同上操作,以试液作空白,分别加入NaNO2.2.1.总黄酮含量的测定精密称取银杏叶提取物约0.02g,置10ml量瓶中加30%乙醇溶液,按上述方法操作并用30%乙醇定容,测定,用回归方程计算总黄酮的含量,结果见表1。2.2.2高效液相色谱法2.2.2.流动相0.4%磷酸溶液色谱柱:RCMC18(8.0×1.0cm,粒度:5μm)径向加压柱;流动相:甲醇-0.4%磷酸溶液(55:45);流速:1.0ml/min;进样量:10μ1;检测波长:360nm;柱温:25℃。2.2.2.配制0.5%盐酸溶液银杏叶提取物样品制备:精密称取银杏叶提取物0.1g,加甲醇20ml使其完全溶解,加入1.5mol/L盐酸20ml,摇匀,回流2小时,冷却,转入50ml量瓶中并用甲醇定容,过滤备用。银杏叶样品的制备:取银杏叶1.5g,在索氏提取器中用甲醇提取8小时,60℃以下浓缩至15ml,加入1.5mol/L盐酸20ml,混匀,回流2小时,冷却,转入50ml容量瓶中并用甲醇定容,过滤备用。2.2.2.黄酮含量测定(1)三对照品测定方法银杏叶提取物酸水解后主要为3中甙元:槲皮素、山柰酚、异鼠李素,按上述色谱条件可将这3种甙元完全分开,用外标法进行含量分析,以3个对照品对6份银杏叶提取物和5份银杏叶样品进行测定,结果见表1,表2。(2)单对照品测定法标准曲线:将浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.07mg/的槲皮素对照品溶液分别进样,以面积(A)对相应的进样量Q(μg)计算回归方程:A=3.800×10按上述方法对银杏叶提取物及银杏叶样品总黄酮含量测定,峰面积乘以校正因子2.51,再求出含量,结果见表1,表2。精密度测定:取浓度为0.02mg/ml的槲皮素对照品溶液,按上述条件重复进样6次,每次10μl测得其精密度RSD=3.2%(n=6)。回收率测定:精密称取银杏叶提取物0.1g,加入槲皮素对照品2mg,按上述方法测槲皮素的回收率,得平均回收率为97.9%,RSD=2.12%(n=5)。2.3提取工艺条件的选择2.3.1条件1色谱柱:RCMC2.3.2样品溶液的制备银杏叶提取物样品制备:精密称取银杏叶提取物0.1g,加甲醇20ml使其完全溶解,加入1.5mol/L盐酸20ml,摇匀,回流2小时,冷却,转入50ml量瓶中并用甲醇定容,过滤备用。2.3.3总黄酮提取率的测定分别配制不同浓度的乙醇(10%~90%)、甲醇(10%~70%)、丙酮(20%~80%)水溶液(v/v)作为提取剂,加入银杏叶100g,用量为8倍银杏叶量,回流提取3小时,过滤,真空浓缩、干燥,称重,测总黄酮含量,计算总黄酮提取率。结果显示以60%丙酮水溶液为提取时,总黄酮提取率达71.2%,但提取液中脂溶性成分较多,杂质含量高,后处理困难。比较甲醇和乙醇水溶液的提取效果,乙醇优于甲醇。当乙醇尝试增大到70%以上时,总黄酮提取率趋于稳定,一次提取率达68%以上,所以选用70%的乙醇较宜。2.3.4总黄酮提取率测定取经除杂,切条的银杏叶1000g于20L的提取釜中,加入10倍量的70%乙醇,水浴加热回流6小时,每隔1小时取样50ml,过滤,真空浓缩、干燥、称重,测量总黄酮含量,计算总黄酮提取率。结果显示回流3小时后总黄酮提取率随时间延长变化趋小,提取率为68%以上。另取同样银杏叶一份,加入10倍量的70%乙醇,回流3小时后,滤出提取液,再加入10倍量的70%乙醇,进行第二次回流提取,每隔1小时取样50ml,过滤,真空浓缩、干燥、称重,测总黄酮含量,计算总黄酮提取率,共提取4小时。结果表明显示第二次回流2小时后总黄酮提取率趋于稳定,第二次总黄酮提取率达15%以上。两次提取率之和达83%以上。2.3.5总黄酮提取率测定取银杏叶100g,加入不同量的70%乙醇水溶液分别进行回流提取,3小时后过滤,真空浓缩,干燥,称重,测定其总黄酮含量,计算总黄酮提取率。结果显示,当液固比从4增大到8时,总黄酮提取率可以从31.1%增大到68.5%,并趋于稳定。2.3.6提取温度的确定分别取银杏叶100g按液固比为8:1的比例加70%乙醇,回流提取两次,第一次3小时,第二次2小时,合并提取液,减压回收乙醇在40-105℃之间选择不同的温度进行真空浓缩、干燥,制备提取物,测定其总黄酮含量,计算总黄酮提取率。结果表明总黄酮提取率随浓缩、干燥温度降低而趋于稳定(在82%左右)。至此,确定银杏叶提取工艺为:以70%乙醇为提取溶剂,用量为银杏叶8倍量,回流浸提两次,第一次3小时,第二次2小时,合并提取液,减压浓缩,回收乙醇,60℃减压浓缩至粘稠状,60℃真空干燥箱干燥24小时。2.4、工艺条件的选择2.4.1萃取溶液的制备按上述确定的提取工艺路线制得银杏叶提取液,于60℃减压浓缩,回收乙醇。残渣加10倍量的无盐水,管式离心机离心除去杂质,备用。2.4.2黄酮含量测定提取液经DM130树脂柱吸附,用无盐水冲洗至流出液澄清,再用70%乙醇洗脱,收集流出液至无色,流出液经减压回收乙醇,浓缩、干燥、粉碎,得银杏叶提取物,称重并以3.1的方法来测总黄酮含量,结果见表3。表3数据说明了,树脂吸附单次解吸工艺所得提取物总黄酮平均收率达77.96%,但总黄酮含量偏低(平18.18%)。2.4.3黄酮含量的测定提取液经DM130树脂柱吸附,用无盐水冲洗至流出液澄清,然后用5%(V/V)稀乙醇溶液预洗(用量是柱体积的3倍),再用70%乙醇洗脱解吸,至流出液无色为止,洗脱液经减压回收乙醇,60℃减压浓缩、真空干燥24小时,粉碎,得银杏叶提取物,称重并以3.1的方法来测定总黄酮含量,结果见表4。表4数据说明了采用分组解吸工艺可以提高银杏叶提取物总黄酮的含量(平均达26.45%),但降低了总黄酮收率(平均67.21%),这主要由于用分级解吸,黄酮将随稀醇液流失。2.4.4总黄酮含量的测定提取液经超滤器超滤,滤出液(或透过液)直接用DM130树脂柱吸附,截留下来的部分返回超滤器料液中,如此循环,当截留部分达原体积的1/10时完成超滤。用少量的无盐水冲洗树脂柱,再用70%乙醇洗脱,收集流出液至无色,流出液经减压回收乙醇,60℃减压浓缩,真空干燥24小时,粉碎,得银杏叶提取物,称重并以3.1的方法来测定总黄酮含量,测定结果如表5。表5数据说明了,利用膜超滤树脂吸附单次解吸工艺制备的提取物总黄酮的含量较高(平均达25.84%),总黄酮平均收率也较高(78.83%)。3、主要结果见表13.1、关于银杏叶提取物总黄酮含量的测定方法,目前,常用的方法有紫外可见分光光度法和高效液相色谱法。从文中表1和表2看出,紫外可见分光光度法与目前认为可靠的方法(即银杏叶提取物水解后以三对照品溶液用高效液相测定银杏总黄酮含量的方法)相比,干扰因素较多,结果偏高。这可能是因为银杏叶提取物中含有多重二糖苷外,还含有单糖苷和甙元。若均按二糖苷计算,易导致结果偏高;若乘以校正因子(0.78)则结果与高效液相色谱法相近。表1数据经校正后,与高效液相色谱法相差0.45-1.55%,基本上满足测定要求,且使用仪器简单、测定结果较稳定,可作为工厂生产工艺的质量控制手段。单对照品法与三对照品法相比,结果没有明显差别,且单对照品法线性范围较宽、回收率好、精密度高、经济简便,可以满足银杏叶及银杏叶提取物总黄酮的测定。3.2、实验过程中发现银杏叶提取物(主要总黄酮)含量有多羟基易氧化成分,随着在提取过程中的温度升高和加热时间的延长,颜色明显加深,若在加热过程中加入少量的硼砂和亚硫酸氢钠,可能是对酚羟基的保护作用,则结果有明显的、控制工作.(内文见下页)改善。因此笔者认为,在开发银杏制剂的时候,为了保持活性成分的稳定,应该对提取物中氧化因素加以考虑,在工艺过程中采取必要的抗氧化措施。3.3、有关银杏叶提取工艺的报道不少,但不尽相同。除了不考虑这些因素外(原材料即银杏叶来源的地区、气候、采收季节等),本文对银杏叶提取物的提取工艺条件和精制工艺条件,作了进一步的探讨。经过实验、测定、对比,确定了银杏叶的提取工艺为:以70%乙醇为提取溶剂,用量为银杏叶8倍量,回流