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第八章抗体分离纯化及测定食品学院廖振林1/126第一节抗体分离纯化

无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗,均需反抗体进行分离与纯化。分离:将抗体从其存在体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。纯化:提升分离出来抗体纯度,并将其中杂质控制在所需低水平。对治疗性抗体尤为主要。2/126分离纯化办法可根据抗体特性进行分离纯化:据蛋白质疏水性差异,以盐析办法将抗体与其他蛋白分开;据抗体带有电荷不一样,用离子交换,电泳等技术分离…..按分离办法:沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。其中只有电泳和色谱法能够将抗体精细分离即纯化。3/126一、盐析法(一)原理蛋白质溶解度在一定范围内随盐浓度变化而变化。在低盐浓度下溶解度伴随盐浓度升高而增加,当盐浓度达成一定水平时,其溶解度又以不一样程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白质分子极性基团有着静电引力,当水中加入少许盐类时,盐类离子与水分子对蛋白质分子上极性基团影响,使蛋白质在水个溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时,水活度减少,蛋白质表面电荷被中和,水化膜破坏,致使蛋白质分子互相聚集而沉淀。盐析法就是根据不一样蛋白质在一定浓度盐溶液中溶解度不一样面达成彼此分离办法。4/126(二)盐选择

蛋白质盐折常用中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广是硫酸铵,其长处是温度系数小,溶解度大(25℃时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L)。在不一样饱和度硫酸铵溶液内,不一样蛋白质依次析出,并且硫酸铵价廉易得,分段效果好,不容易引发蛋白质变性。硫酸铵浓溶液pH常在4.5—5.5之间,市售硫酸铵还常具有少许游离硫酸,pH往往在4.5下列,需用氨水调整其pH至7.0左右。5/126(三)盐析时需注意问题1.盐饱和度盐饱和度是影响蛋白质盐析主要原因,不一样蛋白质盐析要求盐饱和度不一样。分离几个混合组分蛋白质时,盐饱和度常由低到高逐渐增加,每出现一种蛋白质沉淀进行离心分离后,再继续增加盐饱和度,使第二种蛋白质沉淀。如用硫酸铵盐析分离血浆蛋白,当饱和度达20%时,纤维蛋白原首先析出;饱和度增至28%—33%时,优球蛋白析出;饱和度达33%—50%时,球蛋白析出;饱和度大于50%以上时,清蛋白析出。免疫球蛋白常在饱和皮为33%开始析出。6/1262.pH在等电点时,蛋白质溶解度最小.容易沉淀析出。因此,盐析时除个别特殊情况外,pH常选择在被分离蛋白质等电点附近。

3.蛋白质浓度在相同盐析条件下,蛋白质浓度越高越易沉淀,高浓度虽对沉淀有利,但浓度过高,也容易引发其他蛋白质共沉淀,因此,必须选择合适浓度,尽也许避免共沉淀作用干扰。7/1264.温度出于高浓度盐溶液对蛋白质有一定保护作用,盐析操作一般可在室温下进行,但在使用某些中性盐进行盐析时,温度对盐溶解度影响比较显著。

5.脱盐蛋白质用盐析沉淀分离后,常需脱盐才能取得纯品。最常用脱盐办法是透析。通过透析袋内外离子交换,最后使透析袋内溶液盐浓度与外界相一致。当然,也能够使用凝胶过滤或超滤办法除盐。8/126二、膜分离技术

能够形象地将膜分离技术比方成以多孔膜进行过滤或过筛子过程。在实际操作时,由于膜上孔很小,需使用一定压力,才能将具有待分离物质液体驱动通过度离膜,使具有不一样分子量物质或通过膜、或截留于膜上而得到分离。有多种膜技术可用于抗体分离与纯化。9/126但最基本是使用超滤膜。超滤膜孔径在1—100nm之间,其截止到分子量范围为几百至一百万,所需驱动压力在0.1—1.0MPa左右。10/126(一)超滤膜基本性能

作为膜分离材料,超滤膜基本性能能够用透水率和截留分子量加以表征。

1.透水速率在一定驱动压力下,单位面积膜在单位时间里所能透过水量称为该膜进水率(Jf)。11/126式中Jf为进水率,ρ为渗入系数,ΔP为压力差,Δπ是料液渗入压差,ι是透过水流通道长度,它正比于膜厚度。一般情况下,由于Δπ很小,因此能够忽视不计、此时,透水率可简化体现为12/126即透水率与操作压力成正比,与膜厚呈反比。由于膜在使用过程中会发生污染和孔构造变化,因而在使用过程中,其透水率会逐渐发生变化。因此定义其初始运水量Qz和稳定透水量Qs之比为稳定系数Sm,即13/126一般情况下,Sm=0.6-0.8,不一样规格和品种膜透水率相差很大。同步,不一样操作条件与参数,也会对实际透水量产生影响,这些参数包括操作压力、料液流速、温度以及料液性质等。一般情况下,在膜使用开始和结束时,能够实际测定一下透水率。当透水率已经减少时,应考虑将其清洗并再生,以恢复其透水率。14/1262.截留分子量超滤膜另一基本性能是标称截留分子量。它定义是指溶液中被截留溶质中最小分子量。对于“截留分子量”这个指标,不应做机械式理解。例如,使用截留分子量5万膜时,分子量68万牛血清白蛋白也可通透过去。这是由于,一方面,膜上孔大小是不均匀,一般情况下,有一种孔径分布。另一方面,由于分子形状不一样且分子链具有柔性,分子量相同线型分子和球型分子透过率是不一样,线型分子更容易透过。一般,厂家给出截留分于量指是截留率90%时,相对应蛋白质(或其他水溶性高聚物)分子量。在实际使用时应注意下列几个问题:15/126①一般超滤膜截留分子量曲线多呈S形(如图8-1)。S形透过率曲线线性部分越陡,则截留性能亦越佳。②蛋白质分子呈球形者其截留特性优于呈线性者。因此,应注意厂家给出截留分子量是何种物质为样品所测定。一般情况下,裁留率次序为:球蛋白>支链高聚物>直链(线型)高聚物。③厂家给出截留分子量是以单一蛋白质(或水溶性大分子)为样品所测定。不过,实际样品往往极为复杂,如体系中有多种蛋白质存在时,膜特性会由于浓差极化现象、‘‘凝胶层形成”以及样品间形成复合物等现象而有所变化。16/126图8-1

截留分子量曲线17/126(二)常用超滤膜

用于生化分离超滤膜,因使用目标不一样,有很多不一样种类和规格。若按其制造材料分,有醋酸纤维素(CA)、三醋酸纤维素(CTA)、聚砜(PS)、聚酰胺(PA)、聚酰亚胺(PI)、聚丙烯腈轻(PAN)、聚醚醚酮(PEEK)以及聚偏氟乙烯(PVDF)等。其中,以醋酸纤维素和聚砜制备膜最为常用。膜使用形式有平板膜、平板膜堆、管式膜、卷式膜以及中空纤维膜。其截留分子量自500-30万不等,可按需要加以选择。例如,当分离IgG时,若使用截留分子量5万下列膜,均可达成98%高截留率;使用截留分子量10万膜,截留率下降至95%。超滤膜生产厂家很多,但适合于生化分离产品也很有限。表8-1列出了代表件厂家及其产品。18/12619/126三色谱法

(一)概述色谱(chromatography),早期文献上曾翻译为“层析”,具意义是很精确。前国内使用较多则是“色谱”一词。色谱是一种当代分离、分析办法,也是研究物理、化学和生物过程较好工具。色谱分离过程本质是溶质在流动相和固定相之间分派差异。任何两种不一样物质,只要它们存在有不一样物理、化学或生物学性质上差异,并且还体现于在不一样物相上分派系数差异话,它们便都能够在色谱过程中得到分离、分析或测定。20/126这里,所谓不一样物相能够包括气相、液相、固相和超临界相。不一样物相配合,能够得到不一样色谱类型,如气相色谱系以气相为流动相,以固相或载有液相固体为固定相进行物质分离;液相色谱则以液体为流动相,以广义固相为固定相而进行分离。一般,均将固定相装填于柱子中,即以色谱柱形式进行工作。因此,色谱柱是进行色谱分离主要场所。发生在色谱柱中分离过程受热力学原因和动力学原因控制。为得到满意分离,首先必须考虑固定相性质从其与溶质互相作用强弱,这主要体目前色谱柱填料(在生物学文献上常称为“介质”)21/126设计、合成及选择。为使不一样物质尽也许地得到分离,亦即色谱峰尽也许地高而窄(色谱学术语称之为“谱带展宽尽也许地小”),就需要对柱子进行优化设计.并将填料填充成性能优良柱子。同步,由于流动相种类与使用条件既可影响动力学原因,又影响热力学原因,故必须正确地选择并优化色谱条件,才能得到满意分离。22/126

假设有两个溶质A和B,将它们注射进色谱柱后,便会在流动相携带下通过色谱柱并取得分离。在柱子出口处设置一种检测器,便能统计下流经出口溶质浓度变化。这种浓度—时间曲线便是该物质色谱图(图8-2)。色谱图上,能够见到溶质色谱峰:如A峰、B峰。同步,也有不保存物质或杂质形成峰。没有峰时信号轨迹形成基线。从色谱图上,能够直接得到或通过计算得到一系列色谱参数,如保存时间、峰高、峰宽等。表8-2汇总了主要色谱参数及其定义。23/126图8-2色谱图及其参数24/12625/126上面所举出多种色谱参数和名词中,最主要是保存时间TR、保存体积VR、容量因子K’、分离因子α以及分离度R。保存时间和保存体积指是色谱峰出现时间;容量因子,表达样品在固定相上被吸附程度;分离因子表达样品选择性大小;分离度则用以表达两个色谱峰分离程度。按照分离原理不一样,能够将色谱办法提成不一样模式(表8-3)。26/12627/126

当然,表中所例举多种色谱模式,还能够再细分为不一样类别。在抗体分离、纯化中,用得最多是离子交换色谱、凝胶色谱与亲和色谱。在以色谱技术进行抗体分离纯化时,还应注意柱色谱和高效液相色谱(HPLC)区分,方便实现对样品最有效、最合理分离。在一般柱色谱中,多使用软质凝胶或强度较好半硬胶为基质,填料粒径约40-150um。28/126

(二)凝胶过滤

凝胶过滤是体积排除色谱一种。在排除色谱中,溶质即待测样品组分,与填料(或介质)以及流动相之间没有额外互相作用,样品只根据其分子体积(流动力学体积)大小而分离。

1953年,Porath和Flodin首先用交联预聚糖凝胶在水溶液中分离水溶性高分子,其商品名称即Sephadex,由于其突出长处,立即得到了生物医药界认可和广泛应用。这种分离技术被称为凝胶过滤。

1964年出现以苯乙烯—二乙烯苯共聚物为基质不一样孔径有机高分子凝胶,处理了分子量几千至几百万合成高分子体积排除色谱分离问题。其后,体积排除色谱得到了迅速发展并日臻完善,成为高效液相色谱家族中主要一员。29/126凝胶过滤色谱突出长处:①出峰迅速,任何组分保存体积均在Vi和V0之间,且不需要梯度淋洗;②溶质与固定相(填料)和流动相之间没有互相作用;③分离时不会滞留杂质或残留物在柱上,故柱寿命长;④可用以测定生物大分子分子量;⑤生物相容性好,有很高活性回收率;⑥柱负载较大,利于制备分离。缺陷:辨别率及峰容量均相对较低。30/1261.原理凝胶过滤色谱是在装填有多孔性材料色谱柱中进行。多孔材料孔有大有小。孔径有其“孔径分布”,当流动相携带分子量不一样溶质进入色谱柱后,因浓度差而也许渗入或扩散进入填料孔中:也就是说,溶质在两相中运动动力是浓度梯度。不过,分子体积大小,造成了在孔中扩散途径差异,这能够从图8-3看出:31/126单孔中体积排除32/126

形象地说,填料颗粒上孔有大有小,但对于溶剂分子来说,它们是足够大,能够允许它们自由地扩散、进出。不过,对于体积大分子来说,它们只能进入尺寸比它大孔;对于比颗粒上孔还要大分子,则只能从孔旁流过。换句话说,分子量或分子体积较小时,能占有更多孔体积。这样,分子体积不一样混合物一齐进入柱端时.通过淋洗、扩散,总是体积大分子先流出柱子,小分子物质(即体积小)因进入凝胶颗粒,行程延长而滞后流出.从而使二者得以分离。33/1262.常用凝胶种类凝胶是胶体溶液凝结而成固体物质,无论是天然凝胶还是人工合成凝胶,它们内部都具有很微细多孔网状构造。用于凝放过滤常用凝胶有下列几个:(1)交联葡聚糖凝胶(2)琼脂和琼脂糖凝胶

(3)聚丙烯酰胺凝胶

(4)其他凝胶过滤介质34/126(1)交联葡聚糖凝胶

交联葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex),是最早出现凝胶过滤介质。其基本骨架是葡聚糖,由许多右旋葡萄糖单位通过l,6-糖苷键连接成链状构造,再由3-氯-1,2-环氧丙烷作交联剂,将链状构造连接起来形成具有多孔网状构造高分子化合物。其网孔大小可通过调整交联度和葡萄糖百分比以及反应条件来控制,交联度越大,网孔构造越紧密,交联度越小,网孔构造越疏松。交联葡聚糖凝胶化学性质稳定,可工作于pH2-11范围内。表8-4列出了其规格性质。35/12636/126(2)琼脂和琼脂糖凝胶:

琼脂起源于一种海藻,其构造为D-乳糖和3,6-无水-L-乳糖两种糖残基所组成多聚糖。琼脂糖有较大孔隙,允许较大分子渗入,能分离较高分子量物质,其工作范围远大于交联葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶最大缺陷是它带有大量电荷(主要是璜酸基,也有一定量羟基),过滤时常需使用较高离子强度洗脱液,使分离物质中盐浓度过高,影响纯度。因不一样厂家而异,主要商品有Sepharose系列等,其种类和特性见表8-5。37/12638/126(3)聚丙烯酰胺凝胶:

它是一种人工合成凝胶,如生物凝胶-P(Bio-gel-P),产品为颗粒状干粉,在溶剂中能自动吸水膨胀成凝胶。聚丙烯酰胺系内丙烯酰胺经自由基聚合而成线性高聚物,与甲叉双丙烯酰胺共聚能生成交联聚丙烯酰胺,经干燥粉碎或加压成形处理即成生物凝胶-P。除了聚丙烯酚胺凝胶,完全是出碳—碳骨架组成.机械强度较好,合适作为凝胶过滤介质。缺陷是不耐酸,遇酸时酰胺键会水解成羧基,使凝胶带有一定离子交换基团,影响其使用范围。(如表8-6)39/12640/1263.凝胶选择

前述多种凝胶在微观构造上是很相同,它们都是三维空间网状交错高分子聚合物。所能适用分子量范围,主要决定于凝胶颗粒内部微孔孔径大小。混合物分离程度,则取决于凝胶粒度和凝胶构造。凝胶粒度一般分为三级:40—60筛孔属粗粒,100—200筛孔属细粒.250—400筛孔属最细粒;也有厂家将其按粒径划分,即粗(200—600)、中(100—300)、细(40—160)和超细(20—80)四级。其中,以细粒应用较多,由于它能使洗脱曲线峰区变得对称而狭窄;使用过细凝胶时,因洗脱阻力增大,使洗脱时间延长。

41/126与凝胶孔径大小有直接关联是凝胶中琼脂糖或葡聚糖百分比,以及凝胶交联度;凝胶交联度越高,孔径越小,反之孔径就越大。应根据被分离物质分子量大小与形状,选择不一样孔径和文联度凝胶。另外,假如用于脱盐,则宜选择SephadexG25等排阻极限较小凝胶。42/1264.凝胶填装

商品凝胶是干燥颗粒,使用前需充足膨胀。(煮沸可充足溶胀,消毒,除去凝胶中污染细菌。排除气泡)。装柱前凝胶应充足洗涤,除去细颗粒,并减压抽气排除气泡。将处理好凝胶以合适缓冲液悬浮起来,趁其尚未沉降时,均匀而连续地倾倒入垂直放置空柱子中。柱子底部,应预先放有过滤网或筛板。开放柱子底部活塞或螺旋夹,令缓冲液流出,而凝胶则滞留在柱子中形成均匀而稳定柱床。在这一过程中,切忌流干或部分流干。填装软凝胶柱子时,须注意不可使凝胶受到过高压力,不宜使用减压或加压办法;而硬胶,即高交联度凝胶,则可使用水泵减压或以蠕动泵驱动办法加速柱床形成。43/1265.凝胶柱检查

样品分离效果主要取决于装填起来层析床是否均匀。为了确保分离效果,使用前应检查凝胶柱质量。即用肉眼观测层析床是否均匀,有没有“纹路’’或气泡,或向层析床加入大分子有色物质,观测色带移动。色带狭窄,均匀和平整即说明柱子性能良好。色带出现歪曲,散乱,变宽时必须重新填装柱子。44/126(三)离子交换色谱1.原理在合适载体上,例如在纤维素,琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶以及多种合成高聚物型凝胶上,通过酯化、醚化或氧化等化学反应,引入具有碱性或酸性离子基团,便可制备出多种类型离子交换填料。按照表面基团不一样,能够将离子交换填料提成阴、阳两类,其中又有强、中、弱之分。常见四种类型是:强阴型(SAX),如[N(CH3)3]+(QAE)

中阴型(MAX),如一O一(CH2)2一N(C2H5)2(DEAE)

强阳型(SCX),如一SO3-H+(SA)

弱阳型(WCX),如一OCH2COOH(CM)45/126

当离子交换填料带有阳离子基团时,便可交换阴离子样品,称之为阴离子交换树脂;当交换剂带有阴离子基团时,便可交换阳离子样品,称之为阳离子交换树脂。将所需离子交换树脂制备成柱后,便可将其用于蛋白质、酶、激素以及病毒等分离。46/126

通过变化流动相pH值和离子强度,便能以可逆吸附和释放作用,在柱子上分离蛋白质样品,达成纯化之目标。由于多种蛋白质等电点、分子大小、电荷及与离子交换剂结合强度不一样,故可利用不一样置换条件将它们分开。由于多种离子交换剂吸附和释放能力不一样,能够被不一样缓冲液洗脱。有些蛋白质层析时应变化洗脱液PH值。以减少蛋白质分子上电荷数目;或合适增加盐类浓度,与蛋白质竞争结合位置,以减低静电键结合可达成分离(表8-7)。47/12648/1262常用离子交换剂

从标准上讲,任何亲水凝胶均能够作为基质,再通过合适化学修饰而制备出多种离子交换剂。因此,对应离子交换剂也有纤维素、葡聚糖、琼脂糖等系列。根据离子交换剂性能,又可分为阳离子交换剂,阴离子交换剂两大类。表8-8、8-9及8-10为常用某些离子交换剂种类。49/12650/12651/1263.羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)

羟基磷灰石是一种特殊离子交换剂,其主成份为羟基磷酸钙。天然羟基磷灰石属六方晶体,由于有较好生物相容性,故能够用作生物医学材料。1983年Bio-Rad公司生产并开始销售由无定形羧基磷灰石填充高效液相色谱柱。事实上,这种羟基磷灰石系由细小片状结晶所织成,因而柱效、柱子通透性以及柱床稳定性均不是较好。由于粒径减小,使得色谱柱阻力增高,只能用于高效液相色谱,而不能用于一般柱色谱。52/126

正是由于羟基磷灰石化学组成和晶体构造特性,使得它具有独特分离机理。羟基磷灰石晶体上有两种不一样晶面,形成了两种具有不一样吸附特性吸附位点,即位于Ca2+离子上吸附阴离子位点和位于[PO43-]离子上吸附阳离子位点。而OH-不参与吸附过程。这种吸附作用机理,使得它具有很高吸附容量。53/1264、离子交换剂选择和处理(1)选择:如前所述,离子交换剂由基质和带电基团组成,常用有DEAE和CM,前者为弱阴型,后者为弱阳型。常用离子交换剂,现有阴、阳离子之分,也有强、弱之别。因此,应根据纯化蛋白质所带电荷性质及构造,决定离子交换剂以及对应淋洗条件选择;如使用阴离子交换剂,则所应用pH值应高于蛋白质等电点,以使蛋白质呈阴离子性.反之亦然。另外,弱离子交换剂用于分离对电荷具有高亲和力蛋白质,而强离子交换剂则用于分离对电荷具合较低亲和力蛋白质(表8-11)。不过,一般不推荐使用强阳或强阴型离子交换剂,田其有造成蛋白变性之虑。54/12655/126

离子交换刑吸附能力(即样品负载量)取决于离子交换基团含量。离子交换基团愈多,交换量愈大,吸附容量亦愈大。一般,上样量在离子交换剂交换容量5%下列时,可取得较好分离效果。不过,如考虑进行制备型分离,则可不受此限。56/126(2)处理:

处理纤维素离子交换剂时,一般允将所需量交换剂轻轻加入0.5mol/LNaOH溶液中,略加搅拌,待其自然沉降,室温静置30min后清除上清液。然后按0.5mol/LNaOH-0.5mol/LHCl-0.5mol/LNaOH次序处理。每次更换前,需用蒸馏水充足洗涤至中性,CM纤维素和微粒型纤维素在碱洗时不易沉降,可加用0.5mol/LNaCl。葡聚糖制剂不需酸和碱处理,使用时将葡聚糖凝胶放于PBS缓冲液膨胀1—2d(室温),或在中性溶液中煮沸2h,在处理过程中,避免强烈搅动,以避免圆珠构造受损,但不需除去细粒。57/126(四)亲和色谱1、原理亲和色谱是利用生物分子间专一性识别能力、即它们之间所具有亲和力而设计色谱技术:如抗原、半抗原与其抗体、蛋白A和某些抗体之间,均具有专一性亲和力,在一定条件下能紧密结合成复合物,而这种结合又是可逆,变化条件可将它们解离。当把可结合一对分子一方(例如抗原)作为配基,通过一定化学修饰及偶联反应.将其固定化于惰性载体上,便制出了亲和填料,亦即亲和介质(图8-4)。有时由于空间位阻效应存在,使得被分离物难以接近固定化配基.以致会减少样品负载量。58/126亲和介质示意图

载体空间臂配基配原59/126

为此,能够在载体和配基之间连接一种合适长度分子链段,称为空间臂。将制得亲和介质填装成亲和色谱柱,以合适缓冲液为流动相,并令亲和介质对应物(如抗体)随流动相流过该色谱柱,则会因抗原-抗体亲和互相作用,使抗体被吸附于亲和介质上。此时,与该介质没有亲和互相作用力其他物质,随流动相一起被冲出色谱柱。变化流动相组成或淋洗条件,能够将(固定化)抗原-杭体复合物解离,搜集其流出液,便能够得到已纯化抗体。从上述亲和色谱原理可知,它具有极高选择性。有时甚至能够仅用一步分离,便可得到纯度很高产品。60/126亲和力一对亲和物质亲和力,能够用亲和常数,即结合常数来表达,用于亲和色谱时,这一常数不宜过高或过低。过高,则难以洗脱。过低,则因专一性差而选择性不佳。亲和力常数一般在103-108之间。61/1262、载体选择

使配体固相化不溶性化合物称为载体。用于亲和色谱抱负载体应当具有下述特性:①高度亲水,使固相配体易于同水溶液中对应结合物接近;②惰性载体,使载体非专一性吸附尽也许小;③具有相称量化学基团可供活化,并在温和条件下能与较大量配体连接;④有较好物理化学稳定性,不易受周围条件(如pH、离子强度、温度、变性剂和去污剂等)影响;⑤具有多孔网状构造,能使被亲和吸附大分子自由通过而增加配体有效浓度;⑥有良好机械性能,利于控制色谱速度,最佳是均一珠状颗粒。62/126可使用胶种类

凝胶色滞中所使用多种凝胶,均可作为亲和色谱载体。抗体纯化中常用载体为琼脂糖凝胶,它是球状凝胶顾粒、球状琼脂糖凝胶亲水能力很强,物理和化学性质比较稳定。交联型凝胶,即机械强度较高硬胶和半硬胶、在制备型抗体分离上有其特点。它们能够使用较高流速,从而能够得到较高制备效率,也缩短了制备生产周期。膜为载体膜亲和色谱应用:所使用膜材料能够是微滤膜也能够是超滤膜;既可用合成分子膜,也可用滤纸等天然材料将数层膜叠合起来制成膜色谱柱。63/1263、配体选择

在抗体纯化中,既能够使用该抗体抗原,也能够利用该抗体有关特性去制备或寻找适合亲和配体。抗原类似物也能够用作为配基,尽管它们与抗体亲和力一般较小,但选择合适条件,仍然能够得到较好分离效果;另外,固定化金属离子亲和色谱、以组氨酸为配基亲和色谱以及利用亲和标签等办法,均可进行抗体亲和色谱分离。64/126(1)抗原:

根据抗原和抗体能形成抗原-抗体复合物特性,发展了免疫亲和色谱。将可溶性抗原用化学办法偶联到不溶性载体(如sepharose4B)上,使之固相化,并填装入合适色谱柱中,将对应抗血清加入柱中,抗血清中对应抗体就与抗原特异结合,其他蛋白成份随洗液流出。变化缓冲液pH和离子强度,就能够使抗体和偶联在载体上抗原分开而被洗脱下来,从而得到纯净抗体。65/126(2)蛋白A:

蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁一种蛋白成份,它是单一多肽链,分子量为42023,分为5个片段。从N末端开始有4个由58-62个氨基酸残基组成高度同源片段,每个片段都具有和IgGFc段结合活性。不过,就整个蛋白A分子而言,只能与2个Fc段结合,这种结合是一种疏水性作用。变化pH、盐浓度或加入有机溶剂,则能够将IgG从蛋白A洗脱下来。蛋白A具有良好再生性,耐受低pH反复处理性能极佳,并可采取高浓度诸如尿素、盐酸胍或异硫氰酸钾等变性剂进行处理而不致受到破坏,大多数抗体都能耐受短暂低pH处理。66/126(3)蛋白G:

蛋白G是链球菌表面一种蛋白,分子量为30000-35000,它对免疫球蛋白吸附机制与蛋白A相同。蛋白G对多种免疫球蛋白吸附能力与蛋白A不一样.故在抗体纯化上可与蛋白A互补。当某些抗体对蛋白A没有吸附能力时,它们往往会对蛋白G有吸附作用(表8-12,8-13)。67/12668/12669/126(4)蛋白L:

蛋白L是从厌氧链球菌细胞表面分离出来一种蛋白质,分子量约72000。经研究发觉,它能够专一地与κ链相结合。不过,它与λ链结协力却很弱。经深入研究发觉,也并不是所有κ都和蛋白L有亲和力,VκI亚群、VκIII亚群能够和蛋白L结合,而VκII亚群及λ轻链所有亚群则否。另外,蛋白L也能识别大鼠、小鼠、免和灵长类κ链。这样,就有也许利用蛋白L为配基,以亲和色谱去分离人鼠杂交抗体和重组小抗体片段。70/126(5)蛋白H:

蛋白H也是一种由链球菌(APl株)产生表面蛋白。与前面介绍几个蛋白不一样是,蛋白H与免疫球蛋白结合具有温度依赖性。在22度时发生结合,盯在37度时则解离。它能以很高亲和力与人IgGl-IgG4、人IgGFc以及免IgG相结合。不过,不与人IgA、1gD、IgE、IgM以及大鼠、小鼠、牛、绵羊和山羊IgG相结合。蛋白H具有很强种属专一性和温度依赖性。很温和条件下,利用蛋白H去纯化重组人单抗及其片段。71/126(6)组氨酸:早在23年前便已发觉,以组氨酸为配基亲和色谱,可用以分离IgG。有关组氨酸与IgG之间亲和力,不一样条件下有所差异。与组氨酸之间亲和作用力正好适于亲和色谱要求。是一种简单、有效、方便、价廉分离纯化IgG亲和色谱配基。组氨酸能够固定于任何载体上,例如:常用凝胶、交联凝胶、高效凝胶、中空纤维以及其他膜材料上,非常适合制备分离之用。72/126(7)固定化金属离子:

利用带有整合基团凝胶或树脂,将金属离子以整合作用吸附或固定于其上。固定化金属离子能和蛋白质分子链上某些残基,如组氨酸互相作用,产生亲和作用力而实现蛋白质分离。这种办法被称为固定化金属离子亲和色谱(IMAC)或称为金属整合亲和色谱(MCAC)。

IMAC中常用整合基团有亚胺基二乙酸基(IDA)和亚胺基二乙醛基(IDAD)等;常用金属离子有Zn2+、Ni+

、Mg2+、Cu2+等;能够选用任何载体以制备亲和色谱柱。73/126

为深入增强分离效果,能够在设计重组抗体时,在抗体链段N端或C端融合上一串寡聚组氨酸链(6His,4His等),就像给重组抗体加上了一种标签(tag)。这样,便能够用IMAC柱子(带有His融合蛋白一般用镍柱纯化)很方便地将融合蛋白分离出来;得到融合蛋白再以合适办法去掉寡聚组氨酸,就能回收纯化蛋白。这种办法简单、有效,利用得当初,可收到较好效果。(假如要去掉His,采取FactorXaProtease酶解即可)74/126(五)高效液相色谱

前述多种色谱模式,已在生化试验室中取得了广泛应用。不过,人们常为柱色谱(层析)费时和低效而苦恼,通过色谱基本理论研究可知,在填充色谱柱中,填料粒径、形状以及填充柱床紧密程度不均一性,都会对色谱柱性能产生影响。这些效应对柱子理论塔板高度影响,与填料颗粒粒径及粒径分布密切有关。粒径大时柱效低;粒径小则柱效高;另外,填料颗粒粒径分布均匀时,柱效也对应会高某些。因此,为提升柱效,应使用细粒径填料,并要求填料粒径分布尽也许地均匀,甚至使用粒径单分散填料。正是基于这样原理,在20世纪70年代出现了以使用细粒径填料为特性高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)。75/126高效液相组成示意图12345输液系统2进样系统3色谱柱4检测器

5数据处理及控制系统76/12677/126灌流色谱在灌流色谱填料上,现有50-150um微孔,又有贯通整个颗粒600-800um超大孔存在,允许流动相直接进入填料颗粒内部贯通而过。柱子通透性较好,高流速条件下也不需要增加工作压力。因此该种色谱柱同步具有高流速、高效率、高样品负载率和低操作压力(poros柱)。78/126灌流色谱填料示意图扩散孔贯通孔79/12680/12681/126第二节抗体测定

抗体测定.包括抗体纯度、含量、抗体活性、抗体特异性以及抗体亲和力测定等几个方向。这些指标与参数反抗体研究与应用均十分主要.尤其是近年来,伴随越来越多治疗用抗体进入临床,必须严格地控制抗体制品纯度、含量和活性等指标。同步,对与其有关其他某些参数,也需要加以测定。常用办法.如RIA和ELISA等已很成熟。不过,这些办法往往较为啰嗦是需较多时间并难于测定动态过程。因此,需要发展简单、精确、方便、迅速和动态检测新办法。新办法中,最引入注目标是基于表面等离子体共振“生物互相作用体系”

(BIAcore);利用BIAcore,能够迅速、准击、敏捷、方便、及时地测定抗原—抗体互相作用动态过程。相对于常规酶联免疫和放射免疫等办法,这无疑是一种巨大进步。82/126一抗体特异性测定

抗体特异性,指是一种抗体识别只有不一样构造抗原能力。或者说,一种抗体仅与具有特定分子构造抗原才发生显著分子识别作用。一般情况下,抗原与抗体之间特异性互相作用,发生于抗原上抗原决定簇与抗体上抗体结合部位之间。而当其他某种分子也具有类似构造时,它也能与抗体发生类似分子识别作用,这就是交叉反应(crossreaction)。83/126

抗体特异性是决定抗体应用价值关键,能够用多种力法进行测定,其基础均是利用了抗原—抗体特异性互相作用;这种测定能够通过沉淀、凝集等作用直接观测进行.但往往敏捷度较低。近年来,某些新仪器和办法,如酶免疫技术、放射免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术;以及表面等离了体共振(SPR)和石英晶体微天平(QCM)等.被用于直接测定抗体特异性,敏捷度可达成ug/m1或更低。84/126

本节仅介绍酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫荧光测定三种办法。85/126(一)ELISAELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,目前已被广泛用于生物学和医学科学许多领域。

86/126原理:ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体特异性反应与酶对底物高效催化作用相结合起来一种敏感性很高试验技术。由于抗原、抗体反应在一种固相载体─聚苯乙烯微量滴定板孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多出游离反应物,从而确保试验成果特异性与稳定性。在实际应用中,通过不一样设计,详细办法步骤可有多种。即:用于检测抗体间接法、用于检测抗原双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原抗原竞争法等。比较常用是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法87/126ELISA图8-9酶联免疫吸附试验ELISA

底物酶标抗体Ab(待测)Ag88/126ELISA常用酶和底物辣根过氧化物酶,底物为OPD,深桔黄色,检测波长492nmTMB,蓝绿色,检测波长450nm

碱性磷酸酶,底物为PNPP(对-硝基苯磷酸酯),黄色检测波长405nm

ELISA各步骤反应时间

包被:24-36h,蛋白浓度为1-5ug/ml

封闭:37ºC2h或4ºC过夜(3%BSA)样本反应时间:37ºC45min-1h

酶标抗体反应时间:37ºC45min-1h

显色时间:15min(避光)设对照能够一次包被多块板,冻存备用

89/126辣根过氧化物酶标识办法酶标识抗体制备办法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。辣根过氧化物酶标识常用过碘酸盐氧化法,这种办法法只适用于含糖量较高酶。过碘酸钠将HRP分子表面多糖氧化为醛基,醛基与抗体分子上氨基形成Schiff碱而结合。后者可深入用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定酶标识抗体。90/126ELISA常规生色底物辣根过氧化物酶底物:ABTS水溶性HRP底物,在过氧化物酶作用下产生绿色终产物。该绿色产物在410nm及650nm具有两个主要吸取峰。OPD和HRP反应时生成桔黄色产物,在492nm时吸取最大。OPD易溶于底物缓冲液,如StablePeroxidaseSubstrateBuffer。TMB被过氧化氢氧化时(由HRP催化)可形成蓝色产物,主要吸取峰在370nm和652nm。加入硫酸或磷酸后,它会变成黄色,最大吸取峰为450nm。TMB敏捷度很高,达成相同检测敏捷度需要量比ABTS少,但这也也许产生较高背景,因此要求使用较少蛋白或较低抗体浓度。91/126碱性磷酸酶色底物PNPP碱性磷酸酶和PNPP反应后,形成黄色水溶反应产物,该产物在405nm处有光吸光。半乳糖苷酶底物ONPGONPG是一种卓越b-半乳糖苷酶底物。该产品完全可溶,并且在450nm具有高消光系数。它产生一种黄色产物,用1M碳酸钠终止后在可见光范围内进行检测。92/1262类型(1)间接法测抗体间接法是检测抗体常用办法。其原理为利用酶标识抗抗体,检测与固相抗原结合受检抗体,故称为间接法。常用于临床血清中本身抗体检测,以及杂交瘤上清特异性抗体筛选。如血清中PDCD5本身抗体检测。办法:抗原包被封闭待检抗体洗涤酶标二抗洗涤显色反应终止反应ELISAReader检测OD值93/126(2)双抗体夹心法测抗原是检测抗原最常用办法。

只要取得针对受检抗原特异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物。常用组合:单克隆抗体+多克隆抗体单克隆抗体+单克隆抗体后一组合是两种单克隆抗体针反抗原上不一样相距较远两个抗原决定簇,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。用途:测定二价或二价以上大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。例如多种细胞因子检测。94/126双抗体夹心法测抗原办法:捕捉抗体包被封闭(3%BSA)待测抗原洗涤(含0.1%TweenPBS)酶标单抗或多抗洗涤显色检测95/1261)抗体固相测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法两个以上位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,能够采取竞争法模式。其原理是标本中抗原和一定量酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上酶标抗原愈少,最后显色也愈浅。办法:抗体包被封闭同步加入待测抗原和酶标抗原洗涤酶底物显色ELISAreader检测(3)竞争法测抗原96/1262)抗原固相测抗原其原理是标本中抗原和固相抗原与一定量抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多,结合在固相上抗体愈少,最后显色也愈浅。办法:a:抗原包被96孔板;b:封闭;c:待测抗原与抗体反应一定期间;d:加入96孔板

e:洗涤f:加入酶标二抗

g:洗涤h:显色和检测如临床血清样本检测以及细胞培养上清检测97/12698/126(4)IgM抗体检测1)间接法:间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被间接法直接测定血清中IgM抗体,因标本中一般同步存在较高浓度IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上,将出现假阴性成果。因此,假如用抗IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG干扰。办法

a:抗原包被96孔酶标板;b:封闭;c:待测血清与A蛋白反应一定期间后离心

d:吸取上清液加入96孔酶标板

e:洗涤f:加入酶标抗IgM抗体

g:洗涤h:显色和检测99/126(5)ABC-ELISA技术(AvidinBiotinComplex-ELISA原理亲和素是一种分子量是60,000碱性蛋白,由四个相同亚基组成,每个亚基有一种生物素分子结合点。二者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联,又可被酶类等多种材料所标识,成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕捉多种亲和素,后者再与酶结

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