蛋白质研究方法

蛋白质研究办法第1页第一节蛋白质提取第2页目蛋白研究基本流程分离纯化蛋白质

测定蛋白质分子质量蛋白质构造分析蛋白质生物学活性分析摸索构造与功能关系第3页一、蛋白质样品提取目标蛋白获取直接从生物体内获取基因工程体现重组蛋白采取免疫学办法获取有关抗体获取蛋白质编码序列(cDNA)基因组测序基因组测序进行推导获取部分肽段氨基酸序列捕捉对应蛋白质第4页二、典型细胞蛋白质分离纯化流程：清洗组织或细胞裂解细胞离心除去膜组分等取得可溶性蛋白质离心、层析、电泳等深入纯化获取产物蛋白第5页1.细胞破碎多种组织和细胞常用破碎办法细胞破碎办法组织种类

旋刀式匀浆大多数动、植物组织手动式匀浆柔软动物组织高压匀浆细菌、酵母、植物细胞研磨细菌、植物细胞高速珠磨细胞混悬液酶溶细菌、酵母去垢剂渗入组织培养细胞有机溶剂渗入细菌、酵母超声破碎细胞混悬液低渗裂解红细胞、细菌冻融裂解培养细胞

第6页2.去污剂处理溶解膜蛋白

去污剂为双极性(amphipathic)脂类分子，可在水中溶解。一般由线性或带有分枝碳氢化合物尾部和构造各不相同亲水性头部组成SDSTritonX-100NP-40Tween-20第7页3.蛋白质分子稳定

在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以避免蛋白水解PMSF(35ug/ml)EDTA(0.3mg/ml)Pepstatin(0.7ug/ml)Leupeptin(0.5ug/ml)Aprotinin(500unit/ml)

目标：确保蛋白质生物活性第8页细胞内有许多种还原成份，一旦细胞破碎由于和氧接触以及稀释作用而使抗氧化成份减少，造成许多蛋白质被氧化而失去活性，如巯基蛋白常用还原剂

抗坏血酸巯基乙醇(mercaptoethanol)

二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)第9页

蛋白质环境原因

表面效应温度储存第10页4.离心清除细胞碎片5.目标蛋白纯化

1.盐析

(saltingout)2.离子交换层析3.凝胶过滤层析4.亲和层析第11页层析基本理论1923年M.TswettAdsorptionChromatography1941年MartinandSynge

PartitionChromatography

PlatetheoryRatetheory第12页第13页第14页

假设有两种互不混溶溶剂S和M，将A物质溶于一定量S溶剂中，再加入一定量M溶剂

A物质在两相中互相扩散

A物质在两相中达成了平衡(在同一时间内，进出两相A物质分子数完全相等)时，其分派系数为常数

一、分派定律CAS

分派定律表白：

一定条件下，一定物质其K值不变

条件变化其K值随之变化

K值大于1，物质在S相中浓度大于其在M相中浓度CAM=K第15页二、分派层析机理

假设有两种物质，在一定条件下，它们分派系数K不一样，则通过一根分派层析柱能够将它们分离。为了便于讨论，我们做如下几个假设：（1）层析柱可提成许多层，M是流动相，S是固定相，M和S是互不混溶（2）分派层析柱中，每一层左右相通，层与层之间互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵向扩散

分派层析柱理论塔板示意图第16页（3）在分派层析柱中，溶质在两相中达成分派平衡速度很快，并且A物质存在不影响B物质分派性质，反之亦然（4）在该溶剂系统中，A和B两物质分派系数分别设为：KA=CASCAM=1KB=CBSCBM=1/3第17页

假如在层析开始时，在第一层S相中同步加入A和B两种物质，加入量均为1。根据分派定律，M加入后，在两相中立即进行分派，并且很快达成分派平衡。第一次分派前后A和B物质在S和M相中量为：第18页第19页第20页A和B物质在层析柱中1.分派10次；2.分派20次；3.分派30次第21页二者之间总是存在着一定偏差，这是由于：层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散层析过程不也许在绝对分派平衡情况下进行

理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？因此，一般实际洗脱曲线都比理论曲线低而宽第22页

Martin和Synge计算了硅胶柱理论塔板数，求得一种理论塔板高度为0.002厘米

Verzele计算为0.02厘米

1厘米层析柱最少有50个理论塔板，那么，在一根20厘米层析柱上最少能够进行1000

次分派。

一根分派层析柱上究竟能进行多少次分派？第23页塔板理论重点：

分派层析柱象分馏柱同样能够提成很多层，每层为一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定条件下，一根分派层析柱理论塔板数是一定在分派层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩散，并且在两相间达成分派平衡速度很快体系中其他物质存在不影响待分离物质分派。待分离物质存在也不影响其他物质分派在分派层析柱上，物质在各个理论塔板中含量可通过计算求得三、塔板理论第24页第25页6.蛋白质检测和判定光谱学特性190～200nm230～300nm电泳检测SDSIEF分子量测定凝胶过滤层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱氨基酸序列测定用抗体检测蛋白质蛋白质免疫印迹免疫共沉淀第26页

第二节蛋白质定性定量分析第27页

蛋白质定性分析

(qualitativeanalysis)

确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在是何种蛋白质

蛋白质定量分析

(quantitativeanalysis)

确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成份含量第28页一、蛋白质含量测定蛋白质含量测定基于蛋白质元素组成特点基于蛋白质化学显色反应基于蛋白质光吸取特性第29页

蛋白质元素组成特点多种蛋白质含氮量很接近，平均为16％由于体内含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中含氮量，就能够根据下列公式推算出蛋白质大体含量：100克样品中蛋白质含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%第30页1.紫外光谱(A280)吸取法

这一办法可用来迅速检测溶液中是否具有蛋白质成份。一般用于柱层析过程中检测蛋白质洗脱峰第31页原理

色氨酸、酪氨酸最大吸取峰在280nm附近

大多数蛋白质具有这两种氨基酸残基，因此测定蛋白质溶液280nm光吸取值是分析溶液中蛋白质含量迅速简便办法芳香族氨基酸紫外吸取第32页优点迅速缺点核酸可引发强干扰作用芳香族氨基酸含量差异能够起误差对蛋白质无破坏性不是严格定量，适用于测定蛋白质粗提液第33页计算办法标准曲线法蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事项石英比色杯调零所用溶液配制标准蛋白所用溶液光密度范围第34页2.考马斯亮蓝G-250检测法

这是一种迅速、可靠通过染色法测定溶液中蛋白质含量办法第35页原理

该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不一样颜色形式。在一定浓度乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸取值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn光吸取值大小计算蛋白含量第36页所需时间

10min优点迅速（反应时间仅需2min）敏感，几乎没有蛋白质损失缺点用这种测定办法对蛋白质引发不可逆变性对多种纯化蛋白质反应不一样第37页计算办法标准曲线法注意事项反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀若选用目蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确第38页3.Lowry检测法

这一标准、迅速蛋白质定量检测办法已得到广泛应用.第39页原理

首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物深蓝色，这种深蓝色复合物在745～750nm处有最大吸取峰，颜色深浅(吸取值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm光吸取值大小计算蛋白质含量第40页优点一种可靠蛋白质定量办法不一样蛋白质之间差异很小缺点某些试剂不稳定干扰物质多使蛋白质发生不可逆变性第41页计算办法标准曲线法注意事项在加入试剂30min后呈色达成饱和，时间延长颜色信号削弱许多干扰物质减少颜色反应高盐浓度可引发沉淀第42页4.BCA(二喹啉甲酸)检测法

这是近年来新研制一种改善Lowry测定法第43页原理

在碱性环境下蛋白质分子中肽键能与Cu2＋生成络合物，同步将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定有颜色复合物，在562nm处有高光吸取值。颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸取值大小来计算蛋白质含量第44页优点检测敏感性高缺点蛋白质发生不可逆变性终产物稳定巯基试剂和去垢剂干扰第45页第三节蛋白质相对分子量测定分子量测定(molecularweight,MW)凝胶层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳（SDS）质谱(ESI-MS)第46页一、SDS测定蛋白质相对分子量1.不连续系统原理2.SDS凝胶制备制备分离胶制备浓缩胶加样装板电泳卸板并进行凝胶染色第47页3.SDS基本原理

SDS

影响迁移率原因

十二烷基硫酸钠

(SodiumDodecylSulfate)

十二烷基磺酸钠

(SodiumDodecylSulfonate)

第48页

SDS作用：与蛋白牢靠结合，当其浓度大于1mmol/L时，SDS与蛋白质结合百分比为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中多种蛋白质与SDS形成SDS-蛋白质复合物都带有相同密度负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然电荷差异第49页

SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形长椭圆棒状复合物)，并且具有相同荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系第50页

在不连续电泳系统中，具有三种离子，两种不一样孔径凝胶，两种或两种以上不一样pH缓冲溶液所谓不连续就是指凝胶浓度不一样样，缓冲液离子成份及pH不一样样

4.

不连续系统原理概要

在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应由于这三种物理效应，使样品分离效果好，辨别率高第51页

凝胶层不连续性：浓缩胶(stackinggel)

分离胶(separatinggel)

缓冲液离子成份不连续性：快离子(前导离子,leadingion)

慢离子(尾随离子,trailingion)

缓冲配对离子(缓冲抗衡离子,thebuffercounterion)

电位梯度不连续性：在不连续系统中，电位梯度差异是自动形成第52页pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液

甘氨酸HCl蛋白质样品浓缩胶pH6.8分离胶pH8.8样品低电导区第53页

pH不连续性：在浓缩胶与分离胶之间有pH不连续性，是为了控制慢离子解离度，从而控制其有效迁移率浓缩胶pH：6.7

分离胶pH：8.9

缓冲液pH：8.3

由于电泳基质上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离第54页5.SDS测定分子量操作标准品选择及处理待测样品制备电泳分离及染色相对迁移率计算第55页AnalysisforSDSelectrophoresis第56页6.注意事项选择合适胶浓度样品中高浓度阳离子也许会造成SDS沉淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去

SDS与蛋白质之间结合程度蛋白质分子量范围15～200KD之间二硫键是否完全被还原溶液中SDS浓度溶液离子强度第57页第四节测定蛋白质等电点第58页等电点(isoelectricpoint,pI)两性电解质性质支持介质(supportingmedia)第59页+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10IsoelectricFocusing第60页ReadyStripTMIPGStrips3–104–73–65–87–103–10NL3.9–5.14.7–5.95.5-6.76.3-8.3High-puritymonomersNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteinsOverlappinggradientsfor“cybergels”Threelengths7cm,11cmand17cm0.5mmx3.3mm第61页第五节

蛋白质免疫印迹分析第62页

印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析技术

1975年，EdwenSouthern提出了分子印迹(渍)概念目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质检测第63页印迹技术类别及应用

DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体分析

RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA定性定量分析

蛋白质印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及互相作用研究由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术(immunoblotting)第64页一、免疫印迹分析应用对蛋白质进行定性分析对蛋白质进行半定量分析信号转导分析生物大分子互相作用分析第65页二、免疫印迹分析基本流程

电泳分离蛋白

转移至固相膜

封闭非特异结合位点

与第一抗体温育反应

与第二抗体交联物温育反应

显色制备蛋白样品蛋白质转移抗体检测第66页1.样品制备

组织或细胞中提取

裂解

去污剂(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-20)

蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、Pepstatin、

Leupeptin、Aprotinin)

蛋白质定量(Bradford、BCA、Lowry)

基因工程体现重组产物第67页2.电泳分离

SDS

非变性PAGEEIF第68页3.蛋白质电转移办法：半干法、湿法作用：将凝胶上蛋白质转移到硝酸纤维素膜上注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡！？第69页常用蛋白质转移膜种类微孔大小结合能力特点NC膜0.45um80-100ug/cm2应用广泛<20kD易丢失PVDF膜0.22um0.45um80-100ug/cm2170-200ug/cm2<20kD不易丢失容量大、强度高尼龙膜480ug/cm2用于核酸第70页电转移示意图第71页电转移装置第72页4.靶蛋白免疫学检测封闭

—对转移膜上潜在结合位点进行封闭，避免抗体非特异性结合在膜上，减少背景颜色BSA、脱脂奶粉第73页第74页

与第二抗体反应第二抗体一般是针对第一抗体免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标识酶标抗体常用酶：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)胶体金标识、125I标识标识第75页

显色

—AKP可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(bromochloroindolylphosphate，BCIP)与氮蓝四唑(niro-bluetetrazolium，NBT)发生反应，产生深蓝色化合物，显示出蛋白质所在位置。Watchprocedure

—HRP可催化底物显色生成棕色化合物，显示出蛋白质所在位置

—HRP可催化底物发出荧光，显示出蛋白质所在位置第76页四、免疫印迹注意事项

SDS凝胶浓度

膜选择

电转移（方向、电流、转移效率）

充足封闭和洗膜

抗体使用（稀释百分比、分装）

免疫检测（显色）第77页免疫共沉淀

（Co-Immunoprecipitation）第78页免疫共沉淀是以抗体和抗原之间专一性作用为基础用于研究蛋白质互相作用典型办法。原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在许多蛋白质－蛋白质间互相作用被保存了下来。假如用A蛋白质抗体免疫沉淀，那么与A在体内结合B蛋白质也能沉淀下来。这种办法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质新作用靶蛋白。原理第79页长处互相作用蛋白质都是经翻译后修饰，处于天然状态；蛋白互相作用是在自然状态下进行，能够避免人为影响；能够分离得到天然状态互相作用蛋白复合物。第80页缺陷也许检测不到低亲和力和瞬间蛋白质－蛋白质互相作用两种蛋白质结合也许不是直接结合，而也许有第三者在中间起桥梁作用；如用westernblot检查，必须在试验前预测目标蛋白是什么，以选择最后检测抗体，若预测不正确，试验就得不到成果。第81页试验关键抗体性质。抗体不一样和抗原结合能力也不一样，免染能结合未必能用在IP反应。提议认真检查抗体说明书，尤其是多抗特异性是问题。为避免蛋白分解，修饰，溶解抗原缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行试验。考虑抗体/缓冲液百分比。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残余在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。第82页收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min,12023rpm离心30min后取上清；取少许裂解液以备westernblot分析，剩下裂解液加1μg对应抗体加入到细胞裂解液，4°c迟缓摇晃孵育过夜；取10μlproteina琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min；将预处理过10μlproteina琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜细胞裂解液中4°c迟缓摇晃孵育2-4h，使抗体与pro