火炬松dreb1基因的克隆及生物信息学分析

火炬松dreb1基因的克隆及生物信息学分析

干预因子dreb（遗传因素骨髓线）的消息是，结合下游基因启动子中的crt-dre元素（c-receivec），它在不依赖aba的信号调整路径中发挥了重要作用。电子克隆(采用电子克隆的方法,结合火炬松热胁迫cDNA文库EST序列的CAP3组装结果,以及GO注释分析,选择了具有DNA结合特性、核定位信息、转录因子活性等特点的一个Unigene,做进一步的分析,包括基因的一般特征以及其编码蛋白一级、二级、三级结构的预测,为后续该基因的分子功能研究提供一些借鉴。1材料和方法1.1est序列拼接、go释列及目的序列的选择利用火炬松热胁迫cDNA文库EST序列拼接、GO注释的结果,选择目的序列。1.2火炬松假定为火炬松假设选择所得的假定火炬松1.3火炬松的分析利用软件Antheprot分析火炬松1.4功能或功能预测ANTHEWIN5.0软件包含有二级结构预测功能,预测方法有:GORI、Gibrat、DoublePredictionMethod(DPM)、Homologue等四种方法,对1.5级结构预测利用CPHmodel预测该转录因子的三维结构。CPHmodel是丹麦理工大学生物序列分析中心的预测服务器提供的三级结构预测,其方法是基于同源模建,与SWISS-MODEL相比,它简单易学,只需要目的序列,没有高级选项,如提交自定义的模板等。将目的序列提交后,可随即得到结果,不会出现无搜索结果的情况2结果与分析2.1heat1-contig-s1a-119根据火炬松热胁迫cDNA文库EST聚类、拼接及GO注释的结果,发现HEAT1-Contig-h1a-119(见表1),这条序列具有核定位、转录因子活性、DNA结合特性等特点,表明该基因可能是一个转录因子。因此,选择该序列作为目的序列进行下一步的研究。2.2基因编码和分析HEAT1-Contig-h1a-119序列长1293bp,利用DNAMAN预测该片段的可能编码框如图1,发现在六种可能的读码方式中,Plus3含有完整的阅读框(ORF),具有起始密码子ATG和终止密码子TAA,故该片段为一条全长基因,命名为该基因的序列和编码框如图2。1基因编码295个氨基酸,分子量为32.4kD,等电点pI为8.22。编码的氨基酸序列中(图2),丝氨酸含量最高,达13.9%,Leu含量其次(为12.88%),Ala和Gln含量居第三(8.81%),含量最低的是Trp(1.02%),进一步分析发现非极性(疏水)氨基酸含量为39.0%,极性(亲水)氨基酸含量为61.0%,极性(亲水)氨基酸含量明显高于非极性的,由此可见,所编码的蛋白为亲水性蛋白。另外,Blast结果表明,2.3转录因子分析Antheprot预测PteaDREB1中的信号肽序列,如图5所示,发现N端83～87处ARAQP片段为潜在的信号肽断裂位点。另外,丹麦理工大学生物序列分析中心的预测软件SingalIP预测结果也与Antheprot分析结果一致。N端信号肽的存在,对于PteaDREB1作为一个转录因子是必要的。结构位点(Prosite)分析结果显示PsG6PDH中存在9种结构位点:6个N-糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个N-十四酰化位点,1个信号肽酶位点,6个膜脂蛋白脂附着位点,1个半胱氨酸蛋白酶活性位点,1个MYC类型bHLH结构域和2个Myb类型DNA结合结构域。信号肽酶位点、bHLH结构域和DNA结合结构域的存在,为PteaDREB1属于转录因子进一步提供了证据。另外,蛋白激酶位点,表明PteaDREB1行使生理生化功能前或者与其他蛋白互作时可能需要磷酸化的活化。2.4转录因子pteareb1的二级结构及预测结果在Antheprot软件菜单中选择methods/Secondarystructureprediction选项,采用GOR、Gibrat、Homologue、DPM等4种算法预测转录因子PteaDREB1的二级结构,不同方法预测的二级结构不尽相同。4种预测结果进行统计分析,α螺旋的比例均在35%～55%,而β折叠均在20%以下,转角的比例也相对较小,在20%以下。其中Gibrat方法预测的结果虽没有转角,但α螺旋的比例较高,可达55%。2.5同源结构模拟搜索结果显示,PteaDREB1的氨基酸105～165部分与拟南芥CBF1中的AP2(PDB编号1GCC)高度相似,同源性达66.7%。根据同源建模原理,只要目标蛋白与模板蛋白的同源性大于30%,即可进行三级结构的同源模建。因此,对PteaDREB1的氨基酸105～165部分进行同源结构模拟,模拟结果如图6,N和C端附近分别形成β折叠区和α螺旋区,β折叠区有3个β折叠,α螺旋区有5个α螺旋。这是典型的AP2结构域。3在部分品种内分离近年来,随着基因组计划和功能基因组以及蛋白组学的不断发展,在世界三大数据库(NCBI,EBI,DDBJ)中登记的数据越来越多,但分离和克隆新基因仍是当前分子生物学的重点,而且是研究基因结构、功能以及表达调控的基础。分离和克隆基因的经典方法是差减杂交、mRNA差异显示(DDRT)或cDNA末端快速扩增(RACE),这些方法虽然曾成功运用于一些基因的分离,但费时费力、费用高、成功率低,而且在当今海量的数据里,难以得到广泛运用。电子克隆是在基因组计划和EST计划基础上发展起来的基因克隆新方法,具有成本低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。目前松树EST数据非常丰富,而且EST数目每天还在高速增加,利用电子克隆分离松树基因已经成为可能,并将极大加速松树新基因的发现和功能鉴定研究。火炬松是世界南方松中分布最广、生长面积最大、木材年产量最高和蓄积量最大的绿化、造林用速生树种,也被我国广泛引种,但其耐热性较差,严重限制其在南方尤其是广东和海南的推广范围。目前,利用常规育种手段培养耐热性火炬松新品种未见有成功报道,究其原因,可能是常规育种技术定向改良或培育高抗性林木难度比较大,而且时间长。但随着植物基因工程技术的不断成熟和完善,已为林木抗逆性改良提供了一个新途径。而可用林木遗传转化的外源基因的匮乏,是这些年林木基因工程发展缓慢的一个原因,因此,极有必要