duddingoniaflagrans冻干制剂厚壁孢子的培养及其对线虫幼虫的毒杀作用

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动物寄生虫在动物身上很常见，具有分布广泛、感染率高、危害巨大的特点。在使用捕食线虫性真菌对家畜胃肠道线虫进行生物防控方面,许多研究人员做了大量工作。2000年,Baudena等1997年,Fernández等基于此,本研究选择不同的培养基质、培养方法和培养时间对D.flagrans进行培养,计数培养得到的厚壁孢子数量,以评价D.flagrans的培养情况并对最优培养方法进行筛选,然后培养D.flagrans厚壁孢子并将其制备成冻干制剂,研究D.flagrans冻干制剂对线虫幼虫的体外杀灭效果,以期为确定D.flagrans冻干制剂厚壁孢子批量生产的培养方法及其杀虫所使用的参考剂量提供参考。1材料和方法1.1试验材料1.1.1试验中的细菌捕食线虫性真菌D.flagrans,由内蒙古农业大学兽医学院寄生虫学实验室提供,于-20℃冰箱内保存备用。1.1.2传统模式的判定自然感染线虫且未驱过虫的绵羊,由内蒙古农业大学实验动物园提供。试验前用粪袋收集绵羊粪便,根据绵羊粪便中的线虫虫卵及3期幼虫的大小和形态,判定绵羊感染的寄生性线虫主要为食道口属(Oesophagostomun)、夏伯特属(Chabertie)线虫以及捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)。1.1.3培养基的制备吐温-80、琼脂粉和沙氏葡萄糖肉汤培养基,均购自北京化学试剂公司;新鲜玉米粉、玉米粒、大麦粒,均购自集贸市场。0.4g/L玉米粉琼脂培养基(CMA):称取筛网过滤后的新鲜玉米粉20g,置于三角瓶中,加蒸馏水至500mL,微火煮沸1h后补蒸馏水至500mL,多层纱布过滤。取滤液5mL,加蒸馏水495mL,调pH为6.0~6.2,再加琼脂粉20g,加热待其溶解后,于121℃条件下高压灭菌20min,倾注于灭菌玻璃培养皿中,置于4℃下保存备用。0.05%琼脂粉沙氏葡萄糖肉汤培养基:称取10g沙氏葡萄糖肉汤培养基和0.1g琼脂粉,置于三角瓶中,加蒸馏水至200mL,搅拌加热煮沸至完全溶解,分装于50mL三角瓶中,于121℃条件下高压灭菌20min,置于4℃下保存备用。孢子洗脱液:吸取2mL吐温-80,加入1000mL蒸馏水中,微热并晃动使吐温-80与蒸馏水充分混匀,然后分装于500mL三角瓶中,于121℃条件下高压灭菌20min后备用。玉米粒和大麦粒培养基:将玉米粒或大麦粒用蒸馏水清洗干净后于烘箱内烘干,然后分装于250mL三角瓶内,每种培养基12瓶,每瓶70g玉米粒或大麦粒,加70mL蒸馏水,于121℃条件下高压灭菌20min后备用。1.2仪器、药品和仪器LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;超净工作台,哈尔滨东联仪器有限公司;NHWY-2102C摇床,常州诺基仪器有限公司;SP-02型生化培养箱,湖北黄石恒丰医疗有限公司;BX51TF-OLYMPUS显微镜,日本奥林巴斯公司;血细胞计数器,上海求精生化试剂仪器有限公司;MODULYOD-230型真空冷冻干燥机、移液器,美国Thermo公司。1.3测试方法1.3.1培养基的制备即在玉米粒或大麦粒培养基中批量培养D.flagrans厚壁孢子,具体步骤如下:在无菌条件下,先将长满D.flagrans菌丝的0.4g/L玉米粉琼脂培养基均分为6块,之后分别取出3瓶玉米粒和3瓶大麦粒培养基,每瓶放入等量的捣碎琼脂块并搅拌振荡混匀,于25℃恒温培养箱中培养。1.3.2d.flagrans培养基的制备即液体培养基加固体培养基两阶段批量培养,具体步骤如下:在无菌条件下,先将长满D.flagrans菌体的0.4g/L玉米粉琼脂培养基均分为6块,之后分别捣碎并等量加入到6瓶事先制备好的含0.05%琼脂粉的沙氏葡萄糖肉汤培养基中,于25℃、100r/min的恒温摇床中培养7d。然后将培养好的D.flagrans琼脂粉沙氏葡萄糖肉汤培养基分别倒入3瓶玉米粒和3瓶大麦粒培养基中,搅拌振荡混匀,于25℃恒温培养箱中培养。1.3.3厚壁孢子的洗脱与计数在无菌条件下,将上述2种批量培养方式(单步批量培养法和双步批量培养法)下培养的玉米粒培养基和大麦粒培养基,分别在第3,4和5周时用制备好的孢子洗脱液少量多次洗脱D.flagrans厚壁孢子,最后再用孢子洗脱液将孢子悬液均定容到10mL,充分混匀后置于400倍显微镜下血细胞计数板计数,确定每克培养基所含的D.flagrans厚壁孢子数量。1.3.4厚壁孢子的收集和包装使用筛选出的最优培养法培养D.flagrans厚壁孢子,之后将洗脱后的孢子悬液收集于三角瓶中并充分搅拌均匀,再用移液器将其分装于备好的冻干玻璃瓶内,每瓶分装2mL(孢子密度为1×101.3.5小鼠粪便的制备用无菌注射用水溶解D.flagrans冻干制剂,备用。用粪袋收集绵羊粪便,将其充分碾碎混匀,放于9cm培养皿中,每个培养皿10g,每组3个,共5组:第1组为空白对照组,只加等量的无菌注射用水并与粪便充分混匀;第2~5组依次按每克粪便2×101.4数据处理和分析对原始数据进行标准化或归一化处理后,用SAS9.0软件进行方差分析,采用Duncan法进行多重比较。2结果与分析2.1培养方法对d.flagrans培养效果的影响由D.flagrans培养结果可以看出,当其产生的菌丝长满整个培养基时,玉米粒和大麦粒2种不同培养基中的菌落外观色彩有一定差异,玉米粒培养基中的菌落颜色呈微黄色(图1),单步批量培养法和双步批量培养法培养的D.flagrans菌落外观色彩无明显差异;而大麦粒培养基中的菌落呈白色(图1),单、双步批量培养法培养的D.flagrans菌落外观色彩也无明显差异。2.2双步批量培养法在玉米培养基中的双步培养由表1可知,采用单步批量培养法在玉米粒培养基中培养时,培养第3周D.flagrans厚壁孢子数量达到最大值,为2.4×10由表1还可知,采用双步批量培养法在玉米粒培养基中培养时,培养第4周D.flagrans厚壁孢子数量达到最大值,为3.2×10由表1还可看出,利用同一种培养基在2种不同的培养方法下培养时,培养3,4和5周后,每克培养基所含的D.flagrans厚壁孢子数量均有显著差异(P<0.05),且均以双步培养法优于单步培养法。2.3海浓织物海传从外观上看,D.flagrans冻干制剂(图2)呈较疏松的海绵状;血细胞计数板计数结果(图3)显示,每个冻干玻璃瓶内的平均D.flagrans厚壁孢子数量为2×10SAS软件分析发现,绵羊粪便按4×103d.flagrans冻干制剂的制备方法一般情况下,捕食线虫性真菌在营养丰富的环境中通常会生长得非常旺盛,但产孢很少;在低营养培养基上容易产孢,但是生长很差由捕食线虫性真菌D.flagrans冻干制剂体外杀线虫幼虫效果的测定结果可知,D.flagrans冻干制剂杀虫效果良好,其在绵羊粪便中的杀线虫幼虫剂量存在一个阈值。本研究表明,D.flagrans冻干制剂的杀线虫幼虫剂量阈值为每克粪便4×10目前,国内还未见关于捕食线虫性真菌D.flagrans在家畜线虫病防控方面进行商业化生产的报道,但是随着化学驱虫药弊端的日益显现及对动物性食品质量安全要求的不断提高,可以通过制备捕食线虫性真菌D.flagrans新型制剂来对家畜寄生性线虫进行生物防控,而将D.flagrans制备成冻干制剂可将捕食线虫性真菌的保存时间延长至数十年。冻干制剂