基于网络药理学的椭圆叶花锚网络药理学的研究

基于网络药理学的椭圆叶花锚网络药理学的研究

网络药理学是一门新兴的药理学分支学科。根据系统生物学和网络生物学的基本理论，通过使用相关数据库和算法进行深入挖掘、分析和总结，建立药物治疗对象和机制网络。由于它具有完整性和系统性，因此它特别适用于研究中藏药等药物的联合作用、靶点和作用方式复杂的药物作用机制。1仪器、仪器和仪器XevoG2-XSQTof液质联用仪（美国Waters公司）；ACQUITYUPLCHSST3（100×2.1mm1.8μm）色谱柱（美国Waters公司）；Secura513-1CN精密天平（德国赛利多斯）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；N1200BV-W小型浓缩系统（日本东京理化器械株式会社）；EyelaCA-1115B冷却水循环装置（日本东京理化器械株式会社）；EyelaFDU-2110冷冻干燥机（日本东京理化器械株式会社）；Milli-Q超纯水仪（美国密理博），5810R台式高速冷冻离心机（德国艾本德）。甲醇、乙腈、甲酸为质谱级（美国Fisher公司）；氢氧化钠（ACS级）（美国Sigma公司）；亮氨酸脑啡肽（StandardsKitforTOFG2-S）（美国Waters公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水仪制备）；其它试剂均为分析纯。2方法2.1流动相a-1%苯甲酸乙腈溶液椭圆叶花锚样品采集于青海地区，由青海师范大学曾阳教授鉴定为椭圆叶花锚（色谱条件：WatersACQUITYUPLCHSST3色谱柱（100mm×2.1mm，1.8μm），体积流量0.3mL/min,进样量1μL，柱温40℃；流动相0.1%甲酸水溶液（A）-0.01%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱条件：0~1min，99%→90%A；1~10min，90%→74%A；10~14min，74%→34%A；14~16min，34%→1%A；16~19min，1%A；19~20min，1%→99%A；20~23min，99%A；。质谱条件：电喷雾离子源正/负离子模式（ESI利用UNIFI数据处理系统、MasslynxV4.1软件及文献比对，完成色谱峰对应化合物的定性分析，筛选确定椭圆叶花锚的化学成分。2.2chemrafta法提取sdf通过Pubchem数据库（/）对鉴定的化合物检索查询CanonicalSMILES号，未检索到的化合物利用ChemDraw将化合物结构式保存为SDF格式，将SDF格式文件导入OpenBabel获得CanonicalSMILES号；将获得的CanonicalSMILES号上传SwissTargetPrediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/），点击Predicttargets进行预测分析，输出化合物靶点信息2.3蛋白-蛋白相互作用将“2.2”获取的潜在靶点导入String数据库（/），选择“Multipleprotein”，物种选择“HomoSapiens”，下载蛋白相互作用结果，导入Cytoscape3.6.0软件，得到蛋白相互作用网络图。2.4go功能与kegg富集分析将筛选出的椭圆叶花锚治疗肝炎的潜在靶点输入DAVID数据库（/）进行基因本体（GeneOntology，GO）生物学过程分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路富集分析，以2.5椭圆叶花锚化学成分-靶点-通路网络构建利用Cytoscape3.6.0软件构建椭圆叶花锚化学成分-靶点-通路网络图。其中，节点代表化学成分、靶点和信号通路，边用来连接化学成分、靶点和信号通路。2.6主要活性成分化学建模和数据对接对筛选的椭圆叶花锚主要活性成分及核心靶点进行分子对接验证，并用治疗乙型肝炎药物Entecavir做对照分析。首先通过Chem3D19.0对主要活性成分化学结构进行优化，然后用AutoDock4.2.6确定配体可旋转键等，之后从PDB数据库（/pdb）获得关键靶点的3D结构，运用PyMOL2.3.4软件对蛋白质进行去水、去配体等操作，使用AutoDock4.2.6软件对关键靶点进行加氢和计算电荷等处理，最后利用AutoDockVina1.1.2软件进行对接，并用PyMOL2.3.4软件对结果进行可视化处理。3结果3.1总离子流图通过UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析得到椭圆叶花锚总离子流图，见图1。利用UNIFI数据处理系统、MasslynxV4.1软件及文献比对，完成色谱峰对应化合物的定性分析，得到40个化合物，主要包括獐牙菜苷、车叶草苷酸、马钱苷酸、3.2化合物靶点预测结果按照方法“2.2”，利用SwissTargetPrediction数据库对40个化合物进行靶标预测，其中ascorbylglucoside化合物靶点预测结果中Probability>0的结果为0个。将审核过的462个靶点与604个DisGeNET数据库检索与肝炎相关的靶点和9631个GeneCards数据库检索相关靶点，构建韦恩图（图2），得到33个椭圆叶花锚治疗肝炎的潜在作用靶点，靶点信息见表2。3.3蛋白质网络角度按照方法“2.3”，得到蛋白相互作用网络图，如图3所示，节点表示靶点，边表示靶点间关联，靶点大小和颜色与degree值成正相关。该网络共有33个靶点、348条边，平均节点度21.1。其中具有较大度值（degree值>25）的蛋白质有VEGFA、TNF、IL6、MAPK1、CASP3、STAT3、PTGS2、MAPK8、JUN等。通过网络图，能直观看出靶点之间复杂的互作关系，进一步表征了椭圆叶花锚通过多成分、多靶点协同调控治疗肝炎的作用特点。3.4催化酶系统支撑体系的功能调控将“2.2”筛选出的椭圆叶花锚治疗肝炎的潜在靶点输入DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。从生物过程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和细胞组分（cellularcomponent，CC）3个水平对33个靶点进行GO功能富集分析，按照GO分析显示，在生物学过程方面，主要包括白细胞迁移（leukocytemigration）、一氧化氮生物合成过程的正调控（positiveregulationofnitricoxidebiosyntheticprocess）、血小板活化（plateletactivation）、细胞外调节蛋白酶ERK1和ERK2级联的正调控（positiveregulationofERK1andERK2cascade）、平滑肌细胞增殖的正调控（positiveregulationofsmoothmusclecellproliferation）、细胞对糖皮质激素的反应（responsetoglucocorticoid）、FcεRI受体信号通路（Fc-epsilonreceptorsignalingpathway）、磷脂酰肌醇3-激酶信号转导的调控（regulationofphosphatidylinositol3-kinasesignaling）、白细胞与细胞的粘附（leukocytecell-celladhesion）、蛋白质磷酸化（proteinphosphorylation）、肽丝氨酸磷酸化（peptidyl-serinephosphorylation）、细胞形状的调节（regulationofcellshape）、肽基苏氨酸磷酸化（peptidyl-threoninephosphorylation）、磷脂酰肌醇-3-磷酸酯的生物合成过程、（phosphatidylinositol-3-phosphatebiosyntheticprocess）等生物过程。细胞组分方面，靶点涉及膜（membrane）、质膜的外侧（externalsideofplasmamembrane）、膜筏（membraneraft）、细胞表面（cellsurface）、质膜的组成部分（integralcomponentofplasmamembrane）等组分。分子生物学功能方面涉及DNA结合（DNAbinding）、转录因子结合（transcriptionfactorbinding）、转录因子活性，序列特异性DNA结合（transcriptionfactoractivity,sequence-specificDNAbinding）、ATP结合（ATPbinding）、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性（proteinserine/threoninekinaseactivity）、激酶活性（kinaseactivity）、转录调控区DNA结合（transcriptionregulatoryregionDNAbinding）、染色质结合（chromatinbinding）、RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性DNA结合（RNApolymeraseIIcorepromoterproximalregionsequence-specificDNAbinding）、转录激活子活性，RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合（transcriptionalactivatoractivity,RNApolymeraseIIcorepromoterproximalregionsequence-specificbinding）等分子生物功能。KEGG通路富集结果（图5）显示椭圆叶花锚抗肝炎的靶点主要涉及TNF信号通路（14个靶点，42%）、乙型肝炎（11个靶点，33%）、Toll样受体信号通路（9个靶点，27%）、甲型流感（10个靶点，30%）、T细胞受体信号通路（8个靶点，24%）、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）（9个靶点，27%）、胰岛素抵抗（8个靶点，24%）、神经营养蛋白信号通路（8个靶点，24%）、EB病毒感染（8个靶点，24%）、HTLV-I感染（10个靶点，30%）、破骨细胞分化（8个靶点，24%）、丙型肝炎（8个靶点，24%）、FoxO信号通路（8个靶点，24%）等信号通路。3.5椭圆叶花锚治疗麻黄疾病的化学成分按照“2.5”项中方法构建椭圆叶花锚主要成分-靶点-通路网络，其中“菱形”表示化学成分，“圆形”表示抗肝炎作用靶点，“V形”表示通路，由图6可知该网络由92个节点，包括种39种成分、33个靶点、20条通路和307条边，其中化学成分J24、J34、J35、J39、J38、J17、J36、J27、J25、J40等节点较大，表明与其相连的节点较多，可能是椭圆叶花锚治疗肝炎疾病的重要活性成分，另外PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、PTGS2、MAPK1、MAPK14、APP、STAT3、IL6等靶点节点较大，可能是椭圆叶花锚治疗肝炎疾病的重要作用靶点，其中TNF、Toll-likereceptor、FoxO、HIF-1、VEGF、FcepsilonRI等通路可能是椭圆叶花锚治疗肝炎疾病的重要通路。3.6对接能量的活性主要活性成分与关键靶点的分子对接结果结合能见表3。一般认为，对接能量值小于﹣4.25kcal/mol表示两者间有一定的结合活性，小于﹣5.0kcal/mol表示有较好的结合活性，小于﹣7.0kcal/mol表示有强烈的结合活性4椭圆叶花锚潜在的靶点与通路由KEGG通路富集及成分-靶点-通路网络图可知，PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、MAPK1、MAPK14、STAT3、IL6、PTGS2等靶点和TNF、Toll-likereceptor、FoxO、HIF-1、VEGF、FcepsilonRI等信号通路Degree值较大，与其相连的成分较多，可能是椭圆叶花锚抗肝炎的主要潜在靶点与通路。PI3K信号通路是细胞内控制细胞的增殖、凋亡和代谢的关键性信号转导通路MAPKs是众多信号蛋白的一种，其激活调控一系列细胞活动。活化的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关TNF作为一种重要的细胞因子，可诱导细胞内多种信号通路，包括增殖、凋亡、炎症、免疫等。Wang等综上，本研究在椭圆叶花锚化学成分的测定分析基础上，利用网络药理学的分析