DB42-T 1864.4-2022 家禽疫病诊断技术规程 第4部分：禽白血病抗原ELISA检测方法

ICS

11.220CCS

B

41DB42 DB42/T

—2022家禽疫病诊断技术规程第

4

部分：禽白血病抗原

检测方法Code

diseases

seriesPart

Test

method

for

detection

of

avian

leukosis

湖北省市场监督管理局 发

布DB42/T

1864.4—2022 前言

.................................................................................

II引言

................................................................................

III1

...............................................................................

42 规范性引用文件

.....................................................................

43 术语和定义

.........................................................................

44

...............................................................................

45 试验条件

...........................................................................

56 试剂或材料

.........................................................................

57 仪器设备

...........................................................................

58

...............................................................................

69 试验步骤

...........................................................................

710 结果判定

..........................................................................

711 生物安全措施

......................................................................

8DB42/T

1864.4—2022 本文件按照GB/T

—《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件DB42/T

1864《家禽疫病诊断技术规程》为系列标准。本部分为DB42/T

18644部分。DB42/T

1864发布了以下部分：——第

1

部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。——第

2

部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测——第

3

部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜酸菌和空肠弯曲菌三重荧光

PCR

检测方法。——第

4

部分：禽白血病抗原

检测方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、湖北省动物疫病预防控制中心。本文件主要起草人：汪宏才、罗青平、邵华斌、彭伏虎、温国元、王红琳、张蓉蓉、卢琴、罗玲、张腾飞、张文婷、商雨本文件实施应用的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：，邮箱：hbsnab@126.com；对本规程的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，联系电话：，邮箱：397321935@。IIDB42/T

1864.4—2022 2012～2020禽疫病诊断技术规程》系列标准，拟由4个部分构成。——第一部分：家禽主要肿瘤病病原鉴别。目的在于开展家禽

J

亚群白血病病毒、马立克氏病病毒、网状内皮组织增生症病毒的快速检测，指导家禽肿瘤病的快速鉴别诊断。——第二部分：禽大肠杆菌致病群双重探针法检测。目的在于检测家禽泄殖腔拭子和粪便中的致病群大肠杆菌，指导家禽致病群大肠杆菌的快速检测。——第三部分：鸡沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌三重荧光

PCR

检测方法。目的在于检测鸡肉及相关产品、鸡泄殖腔拭子和粪便中的沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌，指导鸡肉及相关产品细菌性疾病的快速检测。——第四部分：禽白血病抗原

ELISA

检测方法。目的在于检测种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原

检测，指导种鸡场禽白血病的净化检测。IIIDB42/T

1864.4—2022

1范围本文件规定了种鸡场禽白血病酶联免疫吸附试验（Enzyme

Linked

Immunosorbent

Assay，ELISA）检测方法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤及结果判定。本文件适用于种鸡群蛋清、血浆、精液、胎粪、肛拭子中禽白血病抗原ELISA检测。2 规范性引用文件文件。GB/T

6682 分析实验室用水规格和试验方法GB

19489 实验室生物安全通用要求GB/T

26436禽白血病诊断技术GB/T

27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测NY/T

禽白血病病毒抗原酶联免疫吸附试验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1禽白血病病毒 avian

leukosis

virus,

ALV可分为A～K

11个亚群，其中与鸡相关且需净化的亚群主要有A亚群、B亚群、C亚群、D亚群、J亚群和K亚群6个外源性病毒。3.2酶联免疫吸附试验

linked

immunosorbent

assay，ELISA术相结合，进行免疫反应的定性和定量检测方法。4 原理本文件采用酶联免疫吸附法（ELISA），该方法利用抗原抗体反应具有特异性，将抗禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体吸附到固相载体的表面后，形成固相抗体。加入待测样本，孵育使待测样本中p27-p27DB42/T

1864.4—2022氧化物酶标记的羊抗兔抗体形成复合物。加入酶反应底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待测物中禽白血病病毒p27蛋白的量直接相关，因此可以根据颜色的深浅来进行定性或定量分析。5 试验条件实验操作应在室温（18℃～25℃）下进行。样品前处理应在二级生物安全柜中进行。6 试剂或材料6.1试剂配制本方法试验用水应按照

6682GB/T27403规定。6.2试剂或材料6.2.1 捕获抗体：抗禽白血病病毒

蛋白单克隆抗体。将

蛋白基因克隆至原核表达载体

pET28a，构建

重组质粒，将其转化大肠杆菌

BL21（DE3），经

IPTG

诱导表达获得

蛋白。将纯化的

蛋白作为免疫原，免疫

Balb/c

小鼠后，取脾细胞与

细胞融合，经过筛选和纯化后，注射小鼠腹腔，生产单克隆抗体。6.2.2 检测抗体：兔抗

蛋白多克隆抗体。以纯化的

蛋白为免疫原，经背部皮下免疫体重约

的日本大耳白兔

3

次。首次将

蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化后，按

1.0

mg/只的剂量免疫。效价较高时心脏釆血，分离血清。经效价测定后，置于-6.2.3阳性对照：禽白血病病毒感染

细胞培养液。6.2.4阴性对照：空白

DF1

细胞培养液。6.2.5 ）：氯化钠（NaCl）8

g，氯化钾（）0.2

gNa24·12H2O）2.9

g，磷酸二氢钾（KH24）

g，加水至

1

000

mL

6.2.6 包被液：碳酸钠（Na2CO3）1.59

g，碳酸氢钠（NaHCO3）2.93

g，加水至

1000mL，置

保存备用。6.2.7 封闭液：牛血清白蛋白（）5

g，氯化钠（NaCl）8

g，氯化钾（KCl）

g，十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4

·12H2O）

2.9

g，磷酸二氢钾（KH24）

0.2

g，硫柳汞钠

g，加水至

1

000

，置

2℃～8℃保存备用。6.2.8洗涤液：氯化钠（NaCl）8

g，氯化钾（KCl）

g，十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）g，磷酸二氢钾（KH2PO4）

g，Tween-20

0.5

mL，加水至

1

2℃～8℃保存备用。6.2.9 底物溶液：3,3',5,5'-四甲基联苯胺（）显色液，置

6.2.10终止液：商品化的终止液。6.2.11 细胞：商品化

细胞及培养基，按照

GB/T

26436

的方法进行细胞准备与培养基配制。7 仪器设备7.1 酶标仪（含有

nm、

nm、

滤光片）。7.2 单通道微量加样器（规格为

100

μL

和

1

000

μL）。7.3 多通道微量加样器（规格为

50

μL、100

μL

和

1

μL）。DB42/T

1864.4—20227.4恒温培养箱。7.5 离心机。8 样品种蛋样品、胎粪样品处理后，可直接进行ELISA检测。精液样品、血浆样品样品按照GB/T

26436的规定接种DF1细胞，培养5天～7天后，取上清液进行直接进行ELISA检测，或将细胞培养物冻融3次后检测。8.1 保存及运输8.1.1

待检样品在

2℃～8℃保存不应超过

h。8.1.2

-20℃保存不超过三个月。8.1.3

-80℃以下可长期保存。8.1.4

样品应置于低温、密封的容器内运输。8.2 处理8.2.1 蛋清

将种蛋按照小头朝上进行摆放，用

酒精棉对小头蛋壳进行擦拭消毒。

击破种蛋小头的蛋壳，用微量移液器吸取

500

μL～1000

蛋清，置于

1.5

将收集的蛋清置于-

2～3

试验时取

μL

直接使用。8.2.2 精液 用含有双抗的

PBS

将精液进行

20～50

倍稀释，3

r/min

离心

3

min，取上清接种

细胞。 置于

37℃培养箱中培养

2

h

后，吸去细胞生长液，加入细胞维持液，继续培养

5

7

天。 取细胞上清液

μL

进行检测。8.2.3 血浆

将血浆样品接种已长满单层的

细胞培养板，置于

37℃含

二氧化碳的恒温培养箱中。

吸去细胞生长液，

洗涤三次，加入细胞维持液，继续培养。

培养

5

天～7

天后，离心后吸取上清液作为检测样品。

试验时取

8.2.4肛拭子 将棉拭子深入泄殖腔内

2

cm

至

3

cm，轻轻旋转

3

圈并沾取少量粪便。 将棉拭子头一并放入盛有

1.5

mLPBS

的无菌离心管中（含青霉素和链霉素各

1

IU/mL盖上管盖并编号。 10

000

r/min

离心

5

后取上清备用。 试验时取

μL

直接使用。DB42/T

1864.4—20228.2.5 胎粪 取雏鸡胎粪，放入盛有

mL

的无菌离心管中。 置于液氮中快速冻融

2

-

2

次，

r/min

5

后取上清备用。 试验时取

μL

直接使用。9 试验步骤9.1 将禽白血病病毒

p27

蛋白单克隆抗体包被于

孔酶标板中，每孔

μL，4

℃过夜，洗涤液洗板

3

次，每次

5

min。9.2 加入封闭液，每孔

μL，37

℃温育

2

h9.3 取出包被板，加入阳性对照、阴性对照各

2

孔，每孔

100

μL。9.4 在其余各孔，分别加入

μL

被检样品。9.5 盖上盖板或塑料贴封纸，轻微震荡后，置于

25℃条件下孵育

40

min。9.6 弃去孔内液体，洗涤酶标板。如果检测样品为蛋清，先加入

200

μL

洗涤液浸泡

1

min～2

min。9.7 每孔加入

300

洗涤液，静置

3

后，弃去孔内液体。重复

3

次，最后一次洗涤后将液体拍干。9.8 每孔加入

μL

兔多抗，盖好反应板，置于

25℃条件下孵育

。9.9 重复步骤

。9.10 每孔加入

μL

酶标抗体溶液，盖好反应板，在

18℃～25℃条件下孵育

min。9.11 洗涤

3

次。9.12 每孔加入底物溶液

μL，立即室温避光显色

10

min。9.13每孔加入

终止液终止反应。9.14 立即将反应板置于酶标仪下，读取

波长下的吸光度（

值）。10结果判定10.1 质控标准阴性对照OD均值