防腐挑战实验调研结果

防腐挑战实验调研结果1实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。2微生物挑战性实验2.1实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）表1某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株菌株美国(药典)美国(ISP公司)英国(药典)德国(Henkel公司)德国(S&M公司)白假丝酵母√√√√√黑曲霉√√√√√红色青霉√绿色木霉√绳状青霉√大肠埃希氏菌√√√√镉绿假单胞菌√√√√金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√产气肠杆菌√表皮葡萄球菌√日勾维肠杆菌√洋葱假单胞菌√√肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√表2CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择种类菌株数量革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌至少选一种表皮葡萄球菌发酵革兰氏阴性杆菌肺炎克雷伯氏菌至少选两种阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌变形菌属日勾维肠杆菌非发酵革兰氏阴性杆菌铜绿假单胞菌至少选一种洋葱假单胞菌荧光假单胞菌恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属酵母白假丝酵母至少选一种近平滑假丝酵母霉菌黑曲霉至少选一种黄绿青霉产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上2.5培养细菌放在32.5±2.5℃霉菌在22.5±2.5℃的培养箱中培养混合菌在28℃2.6菌落计数分别在0、7、14、21、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。菌落计数的标准方法：①先选取平均菌落数在30～300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；②有两个稀释度在30～300之间，求比值。若比值≤2，报告平均数；若比值>2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；⑤所有稀释度均在30～300之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30或300的平均菌落数计算；⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后×2，以报告全皿菌落数。2.7评价标准2.7.1CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ml）和1000000cfu/g（ml）（CFU为菌落单位），要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。2.7.2美国评价标准在CTFA评价方法的基础上提出的标准，如表3所示。表3美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌的28天微生物挑战实验防腐效果优良若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到100cfu/g（ml）以下，第28天全部为0。防腐效果勉强通过若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到1000cfu/g（ml）以下。防腐效果无效若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求。2.7.3国内评价标准国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准。表4国内所用微生物防腐挑战实验评价标准评价标准一次加菌的28天微生物挑战实验重复加菌的微生物挑战实验防腐效果优良（W）第28天化妆品中存货的细菌数量<10CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数<100CFU/ml防腐效果尚可（M）第28天化妆品中存货的细菌数量<100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有一定的抑杀效果。在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数<1000CFU/ml防腐效果差（P）第28天化妆品中存货的细菌数量>100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数>1000CFU/ml第二部分实验室可采取的方案1实验样品2微生物挑战性实验2.1实验菌株金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌2.2培养基牛肉膏蛋白胨培养基2.3试验用菌液的配置实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于37℃（细菌）和28℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（10^8CFU/ml）和霉菌悬液（10^6CFU/ml），置于2.4一次加菌的28天微生物挑战实验量取样品30ml分别加0.3ml混合菌悬液，使得细菌浓度为10^6~10^7CFU/ml，霉菌浓度为10^4~10^5CFU/ml，充分混匀。将样品在28摄氏度下保存，在接菌0、7、14、21、28d2.6评价标准评价标准一次加菌的28天微生物挑战实验防腐效果优良（W）第28天化妆品中存货的细菌数量<10CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。防腐效果尚可（M）第28天化妆品中存货的细菌数量<100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有一定的抑杀效果。防腐效果差（P）第28天化妆品中存货的细菌数量>100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。附：实验中所需的仪器和药品设备名称需求数量要求用途1冰箱1易清洁消毒存放菌种、标准悬液2电子秤1易清洁消毒样品重量测试3浊度仪1易清洁消毒检测细菌菌悬液之浓度4无菌操作台1易清洁消毒微生物实验用，要求等级10000级5生化培养箱3易清洁消毒细菌、霉菌培养各1台；保存琼脂为液体状态及紧急烘干器皿，需用1台6显微镜1易清洁消毒霉菌总数观测用7移液枪2100~1000uL移取菌液用；备用8恒温水浴锅1易清洁消毒用于油性样品之充分溶解，规格待定9自动灭菌锅1自动物品灭菌用10牛角勺100称取样品用；备用11酒精灯2无菌操作台配套用；备用12200ml烧杯10盛装样品用；备用13500ml烧杯10盛装样品用；备用14150ml三角烧瓶10盛装样品用；备用1510ml试管100配备塞子盛装无菌生理盐水；备用16移液枪枪尖100移液枪配套用；备用17培养皿200（套）细菌、霉菌总数测定用