pwax柱固相萃取-高效液相色谱法检测食品中多种合成着色剂

pwax柱固相萃取-高效液相色谱法检测食品中多种合成着色剂

食品中使用的八种合成色胺是由焦油从焦油中分离得到的，属于偶氮化合物。合成着色剂测定方法有高效液相色谱(HPLC)法、薄层色谱法、示波极谱法等,因HPLC的普及,该方法被广泛使用。国标及文献报道1材料和方法1.1合成阴离子及萃取柱U3000型液相色谱仪(美国ThermoFisher);PWAX固相萃取柱(天津博纳艾杰尔科技):弱阴离子150mg/1ml;液相色谱柱InnovalC1.2标准储备液和标准工作溶液的配制甲醇色谱纯;乙酸锌溶液(1.0mol/L):称取22g乙酸锌,用水溶解并定容至100ml;草酸钾/磷酸氢二钾溶液:称取3.0g草酸钾和7.0g磷酸氢二钾,用水溶解并定容至100ml;柠檬酸溶液:称取20g柠檬酸,用水溶解并定容至100ml;氨水溶液(5%):取5ml氨水用水定容至100ml;pH6水溶液:水加柠檬酸溶液调pH值至6;氨化甲醇溶液(3%):取3ml氨水加入到97ml甲醇中;乙酸铵溶液(0.02mol/L):称取1.54g乙酸铵用水溶解并定容至1000ml,过0.45μm滤膜;合成着色剂标准品:柠檬黄标准储备液(0.5mg/ml)、苋菜红标准储备液(0.5mg/ml)、胭脂红标准储备液(0.5mg/ml)、日落黄标准储备液(0.5mg/ml)、诱惑红标准储备液(1.0mg/ml)、亮蓝标准储备液(0.5mg/ml)和赤藓红标准储备液(1.0mg/ml)(购自中国计量科学研究院),酸性靛蓝固体标准品(纯度≥99.9%,购自Dr.Ehrenstorfer公司);超纯水。标准溶液配制:酸性靛蓝标准储备液(0.5mg/ml):准确称取适量酸性靛蓝固体标准品,用水溶解并定容。混合标准应用液(100μg/ml):分别移取适量合成着色剂标准储备液,用水定容。混合标准系列:准确移取适量混合标准应用液(100μg/ml),用水配制成0.2μg/ml、0.5μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的混合标准系列。1.3样品处理1.3.1样品处理和净化液体饮料、液体调味料、果汁、配制酒类、蜜饯、糖果、果冻等:称取2g样品于15ml聚丙烯刻度离心管中(含二氧化碳的样品可超声波超声15min除去二氧化碳;酒类加热除去乙醇;固体样品加20ml水,加热溶解样品,蛋白质含量高的样品加1ml乙酸锌溶液和1ml草酸钾/磷酸氢二钾溶液,充分漩涡混匀。)用氨水溶液调pH至6左右,用水定容至10ml,10000r/min离心5min,上清液待净化。玉米粉、小米和小米粉等:称取2g粉碎后样品于50ml聚丙烯刻度离心管中,加10ml氨化甲醇溶液,漩涡混匀1min,超声提取15min,4000r/min离心3min,上清液转移至试管中;样品残渣用氨化甲醇溶液重复提取至提取液无色,合并提取液于60℃水浴氮吹近干,用水定容至10ml,10000r/min离心5min,上清液待净化。番茄酱等调味品:称取2g样品于50ml聚丙烯刻度离心管中,加10ml氨化甲醇溶液,漩涡混匀1min,超声提取15min,4000r/min离心3min,上清液转移至试管中;样品残渣用氨化甲醇溶液重复提取至提取液无色,合并提取液于60℃水浴氮吹近干,用水定容至10ml,10000r/min离心5min,上清液待净化。肉制品:称取2g均质后样品于50ml聚丙烯刻度离心管中,加20ml石油醚,漩涡混匀1min,4000r/min离心3min,弃去石油醚层,残渣重复上述过程去脂3次;向样品残渣中加10ml氨化甲醇溶液,漩涡混匀1min,4000r/min离心3min,上清液转移至试管中;样品残渣用氨化甲醇溶液重复提取至提取液无色,合并提取液于60℃水浴氮吹近干,用水定容至10ml,10000r/min离心5min,上清液待净化。1.3.2固相萃取柱的制备预先用6ml甲醇和6ml水活化PWAX固相萃取柱,取5ml上述样品提取液,以1ml/min的速度通过预先活化后的PWAX固相萃取柱;再分别用6mlpH6水溶液和6ml甲醇淋洗固相萃取柱,将固相萃取柱通入空气吹干;最后用6ml氨化甲醇洗脱并收集,60℃水浴氮气吹近干,加1ml水复溶,若溶液浑浊,可10000r/min离心10min,上清液待上机测定。1.4条件1色谱柱C2结果2.1回收率、精密度、标准曲线在1.4色谱条件下检测,柠檬黄、苋菜红、酸性靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝和赤藓红等目标化合物分离度R>1.5,分离良好,测定不受干扰。PDA检测结果见图1;使用UV检测器,通过切换波长,各目标化合物均呈现最大吸收峰,见图2,图3为样品加标色谱图。在11.30min、11.63min分离出3个亮蓝同分异构体色谱峰。见图4。在饮料(康师傅冰红茶)、果酒(蓝莓酒)、果冻(喜之郎草莓味)和调味品(番茄沙司)样品中加入一定量着色剂标准液形成0.4mg/kg、2.0mg/kg、10mg/kg的加标浓度,按照1.3对应的样品处理方法提取净化,进行HPLC分析的结果。8种合成着色剂在PWAX固相萃取柱回收率为73.0%~102.7%、RSD为0.46%~5.35%。见表3。根据GB2760食品添加剂使用标准中合成着色剂的限值要求,配置8种着色剂标准系列0.2μg/ml、0.5μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、20μg/ml,在上述实验条件下检测分析,相关系数r为0.99991~0.99999,显示线性关系良好。见表2。进样一定浓度的标准溶液,以3倍信噪比的峰面积所对应的标准溶液浓度为方法检出限,以10倍信噪比的峰面积所对应的标准溶液浓度为方法定量限。若取样量2.0g,定容至10ml时,取上清液5.0ml上柱,净化液定容至1.0ml,8种着色剂检出限均为0.020mg/kg,对应于上机测试液中的浓度为0.020μg/ml;定量限均为0.060mg/kg,对应于上机测试液中的浓度为0.060μg/ml。2.4番茄沙司和正常值的单因素见表1选取不同类别的代表样品,按照上述方法分析,外标法定量,果冻中胭脂红0.95mg/kg;粉肠中诱惑红4.71mg/kg、赤鲜红0.029mg/kg;番茄沙司中日落黄0.76mg/kg、诱惑红0.057mg/kg、赤鲜红14.57mg/kg;橄榄蜜饯中亮蓝10.65mg/kg;裱花蛋糕中亮蓝36.12mg/kg、赤鲜红10.68mg/kg;橘子味饮料中柠檬黄11.43mg/kg、日落黄12.85mg/kg。3讨论3.1黄、紫菜红和酸性理想为利于色谱峰的分离,选用0.02mol/L乙酸铵溶液与甲醇梯度洗脱。5min内,采用甲醇缓慢上升,使柠檬黄、苋菜红和酸性靛蓝很好分离。柠檬黄、苋菜红、酸性靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝和赤藓红的特征波长分别为428nm、521nm、608nm、509nm、483nm、507nm、625nm和529nm,因此在其出峰时间段设置相应的波长编程模式,以获得最大吸收峰,灵敏度显著提高,也使得8种合成着色剂的最大吸收峰呈现在一张图谱上。3.2着色剂的制备碳酸饮料和配制酒,除去二氧化碳或乙醇后即可上柱净化,操作简便。蜜饯、糖果、果冻、果汁等富含大量的氨基氮和蛋白质等有机物,基体中的蛋白质会把着色剂键合或包裹,直接提取回收率极低,使用乙酸铅-草酸钾磷酸氢二钾沉淀蛋白质后,再用水提取效果好,并且8种合成着色剂加标回收率高,效果满意。小米、玉米、调味品、肉制品中的合成着色剂虽溶于水,但直接用水提取回收率低,氨化甲醇能改善其提取效果,获得满意回收率。3.3合成着色剂的筛选柠檬黄等大多数合成着色剂为苯磺酸钠结构,酸性条件下能被聚酰胺粉吸附,而赤藓红为苯甲酸钠结构,酸性条件难以被聚酰胺粉吸附,所以包括国标GB/T5009.35在内的检测前处理方法只有7种合成着色剂,赤藓红采用的是液-液萃取的方法。本方法使用弱阴离子固相萃取柱(PWAX),可以同时测定柠檬黄、苋菜红、酸性靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝等苯磺酸钠结构和赤藓红等苯甲酸钠结构的合成着色剂。配合全自动固相萃取仪,大大减少试剂用量,自动化操作,简单方便,适合大批量样品检测,易于推广。3.4洗脱前吹干小柱弱阴离子固相萃取柱(PWAX)的填料结构表明:当溶液pKa大于-NH洗脱前吹干小柱是为了将水分吹干,防止后面氮吹时间过长,且如果有过多水分存在,会稀释后面的氨化甲醇,使甲醇的浓度降低,洗脱效果会受影响。用氨化甲醇洗脱,氨水和水的存在是为了抑制-NH3.5蒸发沟通和滤膜过滤国标GB/T5009.35方法是将净化洗脱液水浴蒸发浓缩,实际操作中合成着色剂附着在蒸发皿壁上不易复溶,造成损失。且多种合成着色剂能被再生纤维素等水系滤膜吸附,因此不应使用滤膜过滤样品。本方法将净化洗脱液于60℃水浴氮气吹近干,加1ml水复溶,混匀,若溶液浑浊,可10000r/min离心10min,上清液待上机测定,回收率高。3.6邻位磺化物的制备亮蓝(brilliantblue)为非偶氮类酸性染料,苯磺酸结构,主要有3个同分异构体,其间位磺化物ue5fe对位磺化物ue5fe邻位磺化物=75~85ue5fe15~20ue5fe0~8本实验在国