高效液相色谱法（仪器分析课件）

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高效液相色谱的主要类型及选择1

高效液相色谱仪2

高效液相色谱法基本理论与实验技术3

高效液相色谱仪虚拟仿真训练4

高效液相色谱法的应用5能力目标（1）能对高效液相色谱仪各个部件进行安装和操作；（2）能够预处理样品提高样品处理的回收率，减少系统误差；（3）并能选择合适的检测器以及设置和优化仪器参数，对样品的检测条件进行优化；（4）会对仪器所用的所有溶剂进行过滤和脱气；（5）会正确熟练操作工作站对样品进行分析并出具检测结果的报告；（6）能对实验数据进行正确分析和处理，并准确表述分析结果；（7）能对仪器进行日常维护保养工作，学会排除简单的故障。知识目标（1）掌握高效液相色谱的主要类型及其分离原理；（2）掌握高效液相色谱分析仪的基本构造和工作流程；（3）掌握常用高效液相色谱仪的使用及日常维护；（4）熟悉高效液相色谱分析方法的建立及定性定量的方法等知识要点。素质目标掌握新技术、新设备、新系统的能力等。规范操作，注意安全，遵守实验室各项规章制。强调团队合作。树立全局观念。注重包容融合，释放个人潜能。1高效液相色谱的主要类型及选择新闻背景和斑痕，造成这种现象的罪魁祸首是化妆品中普遍使用的一种防腐剂——对羟苯甲酸甲脂。对羟基苯甲酸甲脂，俗称尼泊金甲酯，是一种古老的防腐剂，长期以来被广泛作用于化妆品防腐剂，在很长时间的使用中，被证明是安全的。

因此，对于此种论断，这些业界人士甚为震惊。

吉川教授的论断从何而来呢？有何理论根据呢？

什么是对羟基苯甲酸甲脂呢？

什么是防腐剂？防腐剂有何功效？化妆品中为何要添加防腐剂？

化妆品中添加防腐剂会引起哪些不良反应？

未来，化妆品中是否可以不添加防腐剂呢？

是否有替代物发挥同样的作用？如何选择理想的化妆品防腐剂？讨论:如何对化妆品中的防腐剂进行检测如何测定化妆品的苯甲酸等防腐剂类物质？请列举以前学过的方法？这些方法有什么缺点？有些沸点比较高，分子量比较大，容易分解的物质需要检测，可以使用气相色谱法吗?新方法引出液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。特点：高压：150-350×105Pa

高效：大于30000塔板/米

高灵敏度：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。GCGC需高温GC采用的流动相为只起运载的几种“惰性”气体，对组分作用小GC分析只限于占有机物总数20%的气体和低沸点的稳定化合物HPLC与GC的比较分析对象及范围流动相的选择操作温度HPLC高效液相色谱法的特点高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较检测器灵敏度极高：UV-10-9g,荧光检测器-10-11g高效高灵敏度高速高效液相色谱经典液相色谱HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高效液相色谱法的特点一、液相色谱的种类液-固吸附色谱液-液分配色谱离子交换色谱离子色谱离子对色谱排阻色谱亲和色谱液相色谱的分类液-固吸附色谱

liquid-solidadsorption

chromatography固定相：固体吸附剂为：硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。液相色谱的分类液-液分配色谱

liquid-liquidpartition

chromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。液相色谱的分类离子交换色谱

ion-exchange

chromatography固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。液相色谱的分类离子色谱

ionchromatography离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。通常情况下，离子色谱可以分为三种类型：离子交换色谱、离子排斥色谱、离子对色谱。

离子色谱以离子间作用力不同为原理。液相色谱的分类离子对色谱

ionpairchromatography原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+

X-后；在两相间分配。液相色谱的分类空间排阻色谱

size-exclusionchromatography固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。

液相色谱的分类亲和色谱

Affinitychromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。液相色谱的分类z项目五高效液相色谱法目录Contents

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高效液相色谱法的应用52高效液相色谱仪认识液相色谱仪

highperformanceliquidchromatograph高效液相色谱仪结构原理图高压泵储液系统进样系统分离系统检测系统记录及数据处理系统废液回收系统高效液相色谱仪的系统由储液瓶、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪或工作站等几部分组成。高效液相色谱仪HPLC仪器包括：1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置此外有些还配有梯度淋洗、自动进样装置。实物图及示意图见所示。高效液相色谱仪He储液瓶分布器过滤2

m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱到检测器Agilent1200详细流程高效液相色谱仪贮液罐材料：应当耐腐蚀，可为玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK）。贮液罐容积：0.5-2.0L。要求：贮液罐放置位置要高于泵体，以保持一定的输液静压。贮液罐在使用中应密闭，以防溶剂蒸发，引起流动向组成的变化，并可防止空气中的CO2，O2重新溶解于脱气的流动相中1.贮液罐高效液相色谱仪⑤在线真空脱气法将真空脱气装置串接到贮液罐于高压泵之间，实现溶剂在进入高压泵之前的连续脱气。脱气效果最优。储液系统辅助件：脱气系统①吹氦气脱气法适于给所有溶剂脱气，脱气效率高，但价格昂贵。②加热回流法③抽真空脱气法外接真空泵，对溶剂抽真空。由于抽真空会引起溶剂组成改变，故不适于混合溶剂。因此要对每种溶剂预先脱气后再进行混合。④超声波脱气法将溶剂倒入超声波清洗器中，用超声波震荡赶走气泡。脱气效果最差。离线脱气法在线脱气法高效液相色谱仪2.恒流高压输液泵作用：就是用较高的压力推动流动相的进入色谱柱。

（1）单柱塞注射型泵（2）双柱塞往复型并联泵工作原理：电动机带动偏心轮转动，偏心轮驱动活塞杆做往复运动，通过单项阀的启动和关闭，定期将贮存在液缸中的流动相以高压连续输出。当改变电动机的转速，调整活塞冲程频率，就可调节输出液体的流量。优点：输液流量恒定；造价低廉；更换溶剂方便，特别适于梯度洗脱。缺点：存在脉冲，引起基线波动；由于流动相直接与柱塞接触，长时间使用流动相中的机械杂质会堵塞单项阀，或磨损阀球。高效液相色谱仪输液泵相关概念：梯度淋洗高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。低压梯度：一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。梯度洗脱：流动相中含有两种或两种以上的不同性极性的溶剂，在梯度过程连续或间断改变流动相的组成，以调节流动相的极性，使每个流出的组分有适当的容量因子k‘，并将样品中的所有组分可在最短的分析时间内得到圆满分离。

梯度洗脱目的：提高柱效、缩短分析时间、改善监测器灵敏度。高效液相色谱仪3.进样装置进样过程：在进样器的取样状态，用注射器将样品在常压下注入样品环。然后转动手柄90度到进样状态，流动相便会把样品环中的样品带入高压柱中。

注意要点：

进样时应将样品定量地瞬间注入进样器，以使样品在色谱柱上端的填料中心形成集中的一点。吸取样品时体积要大于样品环体积。六通阀平头进样器进样装置配有不同体积的样品环，上样体积重复性好，耐20MPa高压。特制的平头注射器，保证不伤进样器。高效液相色谱仪4.分离柱材质：内壁抛光的不锈钢。

分类：

注意：

轻拿轻放，注意方向，柱子使用用前后要充分平衡，避免干柱。直型柱：内径几毫米；长度10-50cm；填料颗粒度5-10μm。

毛细管柱：内径30-50μm；长度几十米。前加预柱：进一步过滤样品。高效液相色谱仪5.检测器作用：

用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。

目前最常用的检测器主要有：○紫外-可见检测器（UVD）

○荧光检测器(FD)

○电化学检测器(ECD)

○示差折光检测器（RID）

○电导检测器（CD)

○二极管阵列检测器（PDAD）○蒸发光散射检测器高效液相色谱仪紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。高效液相色谱仪光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。高效液相色谱仪示差折光检测器除紫外检测器之外应用最多的通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。高效液相色谱仪荧光检测器高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。高效液相色谱仪z项目五高效液相色谱法目录Contents

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高效液相色谱法的应用53液相色谱法基本理论与实验技术能力目标了解液相色谱分离类型及原理。了解液相色谱洗脱液的选取原则及梯度洗脱。会选用液相色谱分析所用的固定相和流动相。知识目标学习目标液相色谱固定相和流动相基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。液相色谱固定相和流动相1．基质的种类

（1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。液相色谱固定相和流动相硅胶的主要性能参数有：

①平均粒度及其分布。

②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。

③比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。

④含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。

⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。⑥端基封尾。在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。液相色谱固定相和流动相（2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。液相色谱固定相和流动相（3）聚合物以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH=13下反复冲洗。所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中，因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢，所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。液相色谱固定相和流动相2．基质的选择硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质，主要用来制成分子排阻和离子交换柱。液相色谱固定相和流动相

常见固定相-----化学键合固定相键合：化学反应（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；C18液相色谱固定相和流动相

常见固定相-----化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

Cc.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N液相色谱固定相和流动相液相色谱流动相液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况。按极性分：按使用方式分：极性、弱极性、非极性；常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。固定组成淋洗和梯度淋洗。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。液相色谱固定相和流动相流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。常用溶剂的极性顺序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)液相色谱固定相和流动相流动相选择选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。液相色谱固定相和流动相色谱的分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照图8-10。高效液相色谱法分离方式的选择一、根据样品的分子质量选择1.相对分子质量小且容易挥发的样品，宜用气相色谱分析。2.相对分子质量在200～2000之间的，宜用液-液色谱、液-固色谱、排斥色谱进行分析。3.相对分子质量＞2000的宜用凝胶色谱法进行分离。

二、根据样品的溶解度选择1.能迅速溶于水的样品，可采用反相液-液色谱法进行分离。2.凡能溶解于烃类的则用液-固吸附色谱法分离。3.若样品溶于二氯甲烷则多用常规的分配色谱和吸附色谱。

三、根据样品的分子结构（官能团）选择1.化合物中有能离解的官能团（有机酸、碱）可用离子交换色谱分离。2.脂肪族或芳香族可以用分配色谱、吸附色谱来分离。一般用液-固色谱分离异构体，用液-液色谱分离同系物。高效液相色谱法分离方式的选择毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis,简称CE)也常称高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,简称HPCE)，是以内径20~200μm的柔性毛细管柱作为分离通道，以高压直流电场为驱动力，对各种小分子、大分子以致细胞等进行高效分离，检测或微量植被等的有关技术的总称。毛细管电泳作为一种经典电泳技术与现代微柱分离有机结合的新兴分离技术，近年来发展迅猛并得到广泛应用。由于CE显示了对生物分子如神经递质，肽，蛋白,核苷酸的分离分析和DNA快速测序等的巨大潜力,符合以生物工程为代表的生命科学对各种对象的分离分析和微量制备的需求,所以它正逐步成为一种常用分析手段。毛细管电泳在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下以不同的速度定向迁移的现象叫电泳。电泳迁移速度(v)可用下式表示：v=uE其中E为电场强度(E＝V/L，V为电压，L为毛细管总长度)。u为电泳淌度。CE所用的石英毛细管柱，在pH>3的情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成双电层。在高电压的作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体向负极方向迁移的现象叫电渗。电渗是毛细管中的溶剂因轴向直流电场的作用而发生的定向流动。各种粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳速度为零，故其迁移速度等于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳速度，故它将在中性粒子之后流出。各种粒子因迁移速度不同而实现分离。毛细管电泳目前，毛细管电泳的分离模式有以下几种。(1)毛细管区带电泳，用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁涂层。(2)毛细管凝胶电泳，在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶，主要用于测定蛋白质、DNA等大分子化合物。另有将聚合物溶液等具有筛分作用的物质，如葡聚糖、聚环氧乙烷，装人毛细管中进行分析，称毛细管无胶筛分电泳，故有时将此种模式总称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶和无胶筛分两类。(3)胶束电动毛细管色谱，在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠，形成胶束，被分离物质在水相和胶束相(准固定相)之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。本模式能用于中性物质的分离。(4)亲和毛细管电泳，在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。毛细管电泳(5)毛细管电色谱，是将HPLC的固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，此模式兼具电泳和液相色谱的分离机制。(6)毛细管等电聚焦电泳，是通过内壁涂层使电渗流减到最小，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别为酸和碱，加高电压后，在毛细管内建立了pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带，聚焦后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器。(7)毛细管等速电泳，采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳倘度不同得以分离。以上各模式以(1)、(2)、(3)种应用较多。毛细管电泳固相萃取(SPE)固相萃取(SolidPhaseExtractionSPE)就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。SPE根据其相似相溶机理可分为四种:反相SPE、正相SPE、离子交换SPE、吸附SPE。与液－液萃取相比固相萃取有很多优点：固相萃取不需要大量互不相溶的溶剂，处理过程中不会产生乳化现象，它采用高效及高选择性的吸附剂（固定相），能显著减少溶剂的用量，简化样品于处理过程，同时所需费用也有所减少。一般说来固相萃取所需时间为液－液萃取的1/2，费用为液－液萃取的1/5。其缺点是：目标化合物的回收率和精密度要低于液－液萃取。固相萃取固相萃取(SPE)固相萃取的简要过程、一个样品包括分离物和干扰物通过吸附剂；、吸附剂选择性的保留分离物和一些干扰物，其他干扰物通过吸附剂；、用适当的溶剂淋洗吸附剂，使先前保留的干扰物选择性的淋洗掉，分离物保留在吸附剂床上；、纯化、浓缩的分离物从吸附剂上淋洗下来。固相萃取一、固相萃取常用的吸附剂（固定相）鉴于固相萃取实质上是一种液相色谱的分离，故原则上讲，可作为液相色谱柱填料的材料都可用于固相萃取。但是，由于液相色谱的柱压可以较高，要求柱效较高，故其填料的粒度要求较严格，过去常用10μm粒径填料，现在高效柱多用5μm的填料，甚至用了3μm的填料（随着HPLC泵压的提高，填料的粒径在逐渐减小）。对填料的粒径分布要求也很窄。固相萃取柱上所加压一般都不大，分离目的只是把目标化合物与干扰化合物和基体分开即可，柱效要求一般不高，故作为固相萃取吸附剂的填料都较粗，一般在40μm即可用，粒径分布要求也不严格，这样可以大大降低固相萃取柱的成本。固相萃取样品的保留和洗脱在固相萃取中最通常的方法是将固体吸附剂装在一个针筒状柱子里，使样品溶液通过吸附剂床，样品中的化合物或通过吸附剂或保留在吸附剂上（依靠吸附剂对溶剂的相对吸附）。“保留”是一种存在于吸附剂和分离物分子间吸引的现象，造成当样品溶液通过吸附剂床时，分离物在吸附剂上不移动。保留是三个因素的作用：分离物、溶剂和吸附剂。所以，一个给定的分离物的保留行为在不同溶剂和吸附剂存在下是变化的。“洗脱”是一种保留在吸附剂上的分离物从吸附剂上去除的过程，这通过加入一种对分离物的吸引比吸附剂更强的溶剂来完成。固相萃取吸附剂的容量和选择性吸附剂的容量是在最优条件下，单位吸附剂的量能够保留一个强保留分离物的总量。不同键合硅胶吸附剂的容量变化范围很大。选择性是吸附剂区别分离物和其他样品基质化合物的能力，也就是说，保留分离物去除其他样品化合物。一个高选择性吸附剂是从样品基质中仅保留分离物的吸附剂。吸附剂选择性是三个参数的作用：分离物的化学结构、吸附剂的性质和样品基质的组成。固相萃取固相萃取选择分离模式和吸附剂时还要考虑以下几点：

1.目标化合物在极性或非极性溶剂中的溶解度，这主要涉及淋洗液的选择。

2.目标化合物有无可能离子化（可用调节pH值实现离子化），从而决定是否采用离子交换固相萃取。

3.目标化合物有无可能与吸附剂形成共价键，如形成共价键，在洗脱时可能会遇到麻烦。

4.非目标化合物与目标化合物在吸附剂上吸附点上的竞争程度，这关系到目标化合物与干扰化合物是否能很好分离。固相萃取z项目五高效液相色谱法目录Contents

高效液相色谱的主要类型及选择1

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高效液相色谱法的应用54高效液相色谱仪虚拟仿真训练z项目五高效液相色谱法目录Contents

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高效液相色谱仪虚拟仿真训练4

高效液相色谱法的应用55高效液相色谱法的应用引入有些防腐剂也是一种不安全成分。目前，市场上只有个别产品不含防腐剂，这样的产品对包装要求很高，且需要快速使用，销售不是特别广泛。因此，大多数护肤品、化妆品中都加入了防腐剂。防腐剂也是一种不安全成分，容易导致皮肤过敏等炎症，不过大品牌使用的防腐剂都经过长期、大量的人体实验，可以放心使用。而小的化妆品公司就很难保证了。化妆品中加入一定量的防腐剂可以有效抑制细菌的生长繁殖。由于防腐剂种类繁多且具有一定的毒性，因此我国《化妆品卫生规范》视其为限用物质，规定了56种防腐剂的使用限量。

能力目标AbilityKnowledge掌握定性分析的原理和方法会利用液相色谱进行定性定量分析能分析所测的数据；并给出结果。知识目标TARTEGS

学习目标高效液相色谱法的应用讨论:高效液相色谱分析的一般流程是怎样的？高效液相色谱分析对样品有什么要求?化妆品能否直接分析?高效液相色谱法的应用高效液相色谱法的应用远远广于气相色谱法。它广泛用于合成化学、石油化学、生命科学、临床化学、药物研究、环境监测、食品检验及法学检验等领域。、在食品分析中的应用食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。二、在环境分析中的应用多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药（如氨基甲酸脂类，反相色谱）残留等。高效液相色谱法的应用三、在生命科学中的应用HPLC技术目前已成为生物化学家和医学家在分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具。其在生化领域的应用主要集中于两个方面：低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感性趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng级或pg级，并要求重复性好、快速、自动检测；制备分离、回收率高且不失活。在这些方面，HPLC具有明显的优势。高效液相色谱法的应用四、在医学检验中的应用体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：1.合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。2.天然药物生物碱（吲哚碱、颠茄碱、鸦片碱、强心甙）等。五、在无机分析中的应用阳离子、阴离子的分析等。高效液相色谱法的应用样品预处理准确称取约1g某化妆品样品置于具塞试管中。加入10ml甲醇振荡后超声提取15min。经0.45um滤膜过滤，滤液为待测液。高效液相色谱法的应用定性分析方案的确定请写出对化妆品中的苯甲酸和对羟基苯甲酸异丙酯的定性分析的实验方案。确定分析条件:色谱柱、柱温、流动相、检测器。选择定性方法：高效液相色谱法的应用高效液相色谱仪操作步骤（1）流动相的处理：过滤、脱气。仪器开机：连接好流动相管道，连接检测系统，打开hplc工作站（包括计算机软件和色谱仪）。管路冲洗：如果有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。试压：初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速