水产品新鲜度化学指标的检测-吲哚的测定

吲哚的测定——分光光度法原理一试剂与仪器二分析步骤三目录页结果表述四吲哚是虾产品中重要的腐败代谢物，是由蛋白质中色氨酸经细菌脱羧酶的作用分解产生，虾产品从新鲜到腐败的变化范围内，吲哚含量呈正相关变化，其测定方法有高效液相色谱法和分光光度法等。吲哚一、原理样品中的吲哚随水蒸气蒸馏蒸出用三氮甲烷萃取，加显色剂振摇，分离出酸层，以乙酸定容，用分光度计测定，标准曲线法定量。二、试剂与仪器1.试剂（1）饱和硫酸钠溶。（2）显色剂:对二甲氨基苯甲醛。

显色剂的配制:溶解0.4g对二甲氨基苯甲醛于5mL乙酸中，加92mL磷酸和3mL盐酸混匀。（3）吲哚标准液:精确称取20mg吲哚，加乙醇溶解，定容至200mL。其浓度为0.10mg/mL,4℃贮存在冰箱内。二、试剂与仪器2.仪器（1）分光光度计。（2）蒸馏装置:使用单独的蒸汽发生器。蒸汽发生器可由1000mL锥形瓶制成。用最短的胶皮管与全玻璃蒸汽蒸馏瓶连接，蒸馏瓶容量应在500mL以上，用500mL锥形瓶作接收器(没有保护层的天然或合成橡胶连接器和塞，会产生不同的蒸馏空白)。2.仪器（3）电子天平:感量为0.01g和0.1mg。（4）分液编斗:125mL.和500mL。（5）均质器。（6）容量瓶:50mL。三、分析步骤1.试样的制备

取500g代表性的样品。在室温下解冻，待样品全部融化后破碎(虾干样品直接破碎)，将试样均分成两份，分别装入样品瓶中，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在18℃以下保存。2.提取称取试样25g~50g(取决于所预计的吲哚量)(虾干称取试样12.5g~25g，并加人等量水浸润2h)，移至均质器中，量取80mL乙醇，加入烧杯中，以3000r/min的速度均质5min。转入蒸馏瓶中，用少量乙醇冲洗均质器，加5滴消泡剂。将蒸馏瓶和蒸汽发生器连接，缓慢地供应蒸汽至开始蒸馏（通入蒸汽不可太猛以免产生过多泡沫）。给热汽发生器提供足够的热量，控制蒸汽发生器，使蒸馏瓶内保持80mL~90mL的体积，约45min内在接受瓶内收集约450mL馏出液，用少量乙醇冲洗蒸馏瓶，并入接收瓶中。将馏出液移至500mL分液漏斗中，加入5mL稀盐酸和5mL饱和硫酸钠溶液。依次用25mL、20mL和15mL三氯甲烷提取，每次用力振摇1min，放气静置分层，先将25mL和20mL三氯甲烧提取液合并到到另一500mL分液漏斗中，依次加入400mL水5mL饱和硫酸钠溶液和5mL稀盐酸洗涤，保留洗涤液，通过脱脂棉将合并的是取液滤入干燥的125mL分液漏斗中。再用同一洗涤液洗涤15mL三氯甲烷提取液，将三氯甲烷合并入同一125mL分液漏斗中。3.测定加入10mL显色剂于合并的三氯甲烷提取液中，用力振摇2min，放气静置，使酸层尽可能地分层。取8.0mL酸层转移到50mL容量瓶中，用乙酸稀释定容，混匀。移取该溶液于分光光度计比色池中，在560m处测定吸光度A。将8.0mL显色剂用乙酸稀释定容至50mL.混匀，测定空白。

通过蒸汽蒸馏一组新制备的吲哚标准工作液，分别移取1mL、2mL、3mL、4mL和5mL按样品测定程序制备标准曲线，不加吲哚标准工作液，按同样方法测定蒸馏空白。四、结果表述按公式计算样品中吲哚含量：式中：X——试样中吲哚含量，单位为微克每千克(μg/kg)；A——从标准曲线上查得的吲哚量，单位为微克(μg)；m——最终测试样液所代表的样品量，单位为克(g)。吲哚的测定——高效液相色谱法原理一试剂与仪器二分析步骤三目录页结果表述四吲哚是虾产品中重要的腐败代谢物，是由蛋白质中色氨酸经细菌脱羧酶的作用分解产生，虾产品从新鲜到腐败的变化范围内，吲哚含量呈正相关变化，其测定方法有高效液相色谱法和分光光度法等。吲哚一、原理试样经乙腈超声提取、稀释后直接采用高效液相色谱法进行检测，内标法定量。二、试剂与仪器1.试剂（1）标准储备溶液：称取50mg吲哚标准品，用乙腈

溶解定容至50mL，配制溶液浓度1mg/mL的标准储备

溶液，1℃~4℃冰箱避光保存，有效期1周。（2）标准中间溶液的配制：用乙腈稀释标准储备溶液

至浓度为10μg/mL，1℃~4℃冰箱避光保存，现配现用。（3）标准工作溶液的配制：吸取适量的标准中间溶液，用乙腈配成适当浓度的标准工作溶液，现配现用。（4）内标标准储备溶液：称取50mg吲哚标准品，用乙腈溶解定容至50mL，配制溶液浓度1mg/mL的标准储备溶液，1℃~4℃冰箱避光保存。（5）内标标准中间液的配制：用乙腈稀释内标标准储备溶液至浓度为10μg/mL，1℃~4℃冰箱避光保存。二、试剂与仪器2.仪器（1）高效液相色谱仪，配有荧光检测器。（2）电子天平：感量为0.01g和0.1mg。（3）旋涡混匀器。（4）超声波清洗机。（5）离心机：5000r/min。（6）容量瓶：50mL.（7）具塞塑料离心管：聚丙烯，50mL.三、分析步骤1.试样的制备取500g代表性的样品。在室温下解冻，待样品全部融化后破碎(虾干样品直接破碎)，将试样均分成两份，分别装入样品瓶中，密封，并标明标记。一份作为试验样，另一份在-18℃以下保存。称取5g试样（虾干称取2.5g样品，并加入2.5mL水浸润2h）于50mL具塞离心管中，腊入250μL内标标准中间溶液，加入20mL乙腈、涡旋混合1min。室温下避光超声10min，离心(4700r/min，3min)，液体部分转移至50mL容量瓶中，残渣再加入20mL乙腈重复提取一次，合开提取液，加乙腈定容至50mL，混匀，过0.22μm滤膜，供高效液相色谱仪测定。3.测定（1）液相色谱条件液相色谱条件如下：色谱柱：C-18柱（ODS-2），250mm×4.6mm（内径），5μm，或相当者；流动相：乙腈/水（65+35），等度洗脱流速：1mL/min;荧光检测器波长：激发波长λex=270nm，发射波长λex=340nm；柱温：30℃；进样量：20μL。（2）色谱测定根据试样中被测样液的含量，选定浓度相近的标准溶液，待测物的响应值应在仪器检测的线性范围内，对标准溶液及样液等体积参插进样测定。以2-甲基吲哚为内标物，以吲哚和2-甲基吲哚的峰面积比值为纵坐标，以吲哚的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用保留时间定性，内标法定量，得到样液中吲哚的浓度。4.空白实验除不加样品外，按样品测定步骤进行。四、结果表