临床病理知识及病理学常用新技术

一.大纲要求技术的原理及应用二.根本内容〔一〕.根本概念biopsy病理检查，以明确病变的性质。冰冻切片快速诊断(frozensextion)：用不经固定的颖标本，快速冷冻至-18进展切片、HE20～30min细胞学检查〔cytology态学的观看，并作出定性诊断。目前主要用于肿瘤的诊断，推断有无肿瘤细胞，是良性或恶性。也用于某些内部器官炎症性疾病的诊断和激素水平的判定等。〔HE染色HE医学领域中最根本也是应用最广泛的染色方法。染色结果：细胞核呈蓝色，胞质、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。钙盐和微生物也可染成蓝色或蓝紫色组织化学技术〔histochemistrytechniqueHE染片内不易区分的病变或物质。免疫组织化学(immunohistochemistry制备的特异性抗体加在组织切片上，使之与相应的抗原结合。特异性抗体通过某种方式连结辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。显色剂在酶的作用下氧化沉淀，将抗体所检测的抗原在组织切片上显示出来。生物芯片技术(biochiptechnique)：是将大量具有生物识别功能的分子或生物样品有序的点阵排列在支持物上并与标记的检测分子同时反响或杂交，通过放射自显影、荧光扫描、化学发光或酶标显示可获得大量有用的生物信息的技术。基因芯片(genechipDNA物外表上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进展杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、高效的检测。组织芯片(tissuechip)：又称组织微列阵(tissuemicroarray)，是将数十个、数百个乃至上千个小的组织片整齐地排列在某一载体〔通常是载玻片〕而成的微缩组织片。FISH从而对组织、细胞中待测的核酸进展定性、定位和相对定量分析的一种争论方法。应用不同的探针可显示某一种物种的全部基因、某一染色体染色片段及单拷贝序列，结合共聚焦激光显微镜可对间期核及染色体进展三维构造争论。比较基因组杂交技术〔CGH：根本原理用不同的荧光染料分别标记正常人基因组DNA肿瘤细胞DNA，然后与正常人中期染色体杂交，通过检测染色体上两种荧光〔红、绿〕的相DNADNADNA流式细胞技术〔FCM高速准确的定量分析和分类。原代培育〔primaryculture：由体内直接取出组织或细胞进展培育。传代培育(subculture)：把细胞自原代培育的培育瓶中分别、稀释，而移至另一的培育瓶中的操作程序，即为传代或再培育，以便持续培育，得到大量同种细胞或建成细胞株，维持细胞种连续。蛋白质组(proteome):指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。〔proteomics式。其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰方式)、构造、功能和相互作用等。〔二〕.临床病理根本学问活检不能用电灼取材。活检的分类及目的：活检分三类：⑴术前活检：在治疗性手术前或其它治疗〔如放疗或化疗〕前所作的活检。常规甲醛固定，石蜡包埋，HE3～7⑵术中活检：在治疗性手术或探查性手术进展中所作的活检。用不固定的颖标本快速冷冻切片，20～30min内完成定性诊断，以便指导手术的进展。其准确率仅在80％左右，不及石蜡切片。其目的：①确定病变的性质，以便确定手术方案；②了解病变的状况，以便确定手术的范围；③确定所取的标本是否含有预定的组织器官或病变。⑶术后活检：对治疗性手术切除的组织器官进展较全面的病理学检查。常规甲醛固定，石蜡包埋，HE3～7淋巴结活检要留意：①有多组淋巴结肿大，避开取腹股沟淋巴结，由于这组淋巴结的慢性非特异性炎症和纤维化最常见，形态背景简洁，不利于特异性病变的诊断；②同一个区域有多个淋巴结肿大，避开取最小的淋巴结；③要将淋巴结完整摘除，切忌将其切成多个不规章10％福尔马林固定，勿用酒精；⑤固定前要将淋巴结切开。0.2～0.3cm1～1.5cm21cmx1cmx0.2cm为好，以免铺张试剂；②对于皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条，较长时可卷成同心圆状；③骨组织需先经过脱钙处理；④组织块如有血液、粘液、粪便等污物，先用水冲洗干净再取材；⑤肿瘤标本取材，应选肿瘤主体、肿瘤邻近组织及肿瘤两端的切缘〔假设管道器官〕分别取材，应留意切取肿瘤与正常组织交界处；⑥颖组织需保存时，应用锡箔纸包好，快速过液氮，于－70o标本固定：⑴.常用固定液及配制方法：1〕单纯固定液：①甲醛，也称福尔马林，一般作为固定液使用的是10％的福尔马林。配制10ml90ml4％pH7.2～7.480％～95％浓度为好。酒精作为固定剂不利于染色质的固定，要证明细胞内的脂肪、类脂质及色素存在的标本不能用酒精固定。混合固定液：①A-FBouinZenker；④Carnoy4％carnoy固定液等。95％酒精。4肿瘤和器官的切开方法：⑴肿块：沿最大径线切第一刀，勿完全切断，以保持标本的完整性。假设肿块较大，可相间1cm⑵甲状腺：沿标本的最大直径作第一个切面。⑶肺叶：通过病灶或肿块作冠状切面。⑷食管：沿病灶对侧纵行剪开管壁。假设整个周径为病变累及，则沿最薄处剪开。⑸胃：沿胃大弯自贲门侧剪开，由于病变多位于胃小弯。假设病变位于胃大弯，则沿胃小弯剪开。⑹肠：沿病灶对侧剪开肠壁。假设不能确定病灶位置，则沿肠系膜附着缘剪开。YT⑼肾：通过肾门作冠状切面。脾：通过脾门与脾长轴垂直切第一刀，然后相距1－2cm作多个平行切面。乳腺：将皮面对下，通过肿块中点与乳头连线切第一刀。假设肿块较大，可相距1cm作多个平行切面。勿切断皮肤，以保持标本的完整性。淋巴结：通过淋巴结门作冠状切面。假设淋巴结最大径线超过2cm，则沿着最大径线垂直方向在该径线中点切第一刀，必要时相距0.5cm平行切其次刀。勿完全切断，以保持标本的完整性。肝：沿病灶最大径线切第一刀。假设病灶较大，则相距1～2cm作多个平行切面。勿完全切断，以保持标本的完整性。胰腺：无论标本大小如何，均沿胰腺纵轴的垂直方向作横切面。常用特别染色方法及应用：⑴结缔组织染色：胶原纤维染色：Masson三色染色法染胶原纤维，结果是胶原纤维呈蓝色，肌纤维和红细VG网状纤维染色用氨性银溶液浸染能使网状纤维变成黑色，又称为嗜银染色。其在肿瘤病可见网状纤维，在肉瘤则是银染阳性的物质分隔单个瘤细胞；②推断原位癌与早期浸润癌，前者基地膜完整，后者基底膜断裂崩解。弹力纤维染色常用于皮肤组织的增殖变化、老年性肺气肿显示纤维断裂、变性或萎缩、高血压病时小动脉管壁弹力纤维的特别增生等，对弹力纤维瘤的诊断有打算作用。糖类染色：CarnoyPAS内空泡的性质、糖原贮积病的诊断及某些透亮细胞肿瘤的鉴别诊断有重要作用。粘液物质染色可用爱先蓝〔AB〕PAS别和证明细胞内是否含有粘液，如鉴别粘液瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠道低分化腺癌等。粘液物质，ABPAS组织中脂类的显示法脂质的抱负固定液是甲醛钙或中性缓冲甲醛，脂肪染色用冰冻切III但对脂肪肉瘤的诊断无明显价值。用刚果红或甲基紫显示淀粉样物质；普鲁士蓝反响可显示含铁的色素。冰冻切片检查的原则：临床需依据病理报告来打算手术的方式或范围时才送标本作冰冻检查。剖腹探查仅仅为了活检时，不能在取出小块组织后就匆忙关腹，须待冰冻报告见到病变组织才能关腹。免疫组织化学检测的作用：①显示组织切片内是否存在某种抗原；②显示该抗原存在于组织或细胞什么部位；③在同等染色条件下，通过比较阳性细胞的数量或强度，可作半定量分析。电子显微镜技术：电子显微镜简称电镜，包括透射式电镜和扫描式电镜两种根本类型。透射式电镜主要用于观看细胞内部的微小构造，检查组织要求超薄切片，即切片的厚度应在50nm左右，不能超过100nm。扫描电镜不需要超薄切片。透射电镜技术可以观看细胞内的细胞器、细胞骨架或大分子水平的变化，在病理诊断中主要用于肾脏的细针穿刺活检标本，来进展肾小球肾炎的分型和肿瘤细胞分化的方向及细胞器的变化。扫描电镜用于观看细胞外表的微小构造和相互关系。〔三〕.病理常用技术激光共聚焦扫描显微镜〔Confocallaserscanningmicroscopy〕可以从组织细胞水平直接进入亚细胞水平观看，且可利用计算机及图像处理系统对组织、细胞及亚细胞构造进展断层扫描，三维立体空间构造再现，将形态学争论从平面图像水平提高到三维立体水平，图像清楚明媚；还可在观看培育细胞形态构造的同时，直接显示活体细胞内的代谢变化等。组织芯片的特点：①体积小、信息含量大，可依据不同需要进展组合和设计；②既可以用于形态学观看、也可用于免疫组织化学染色、原位杂交、荧光原位分子杂交〔FISH〕等原位组织细胞学观看和争论，具有高效、快速、低消耗、良好的自身内比照和可比性强；③可批量制作组织芯片及其试验结果的计算机分析。显微切割技术：目前主要使用的是液压把握手动显微切割〔显微操作仪〕和激光捕获显微切割。用于切割的材料可以是冰冻组织切片、石蜡切片、细胞涂片、细胞铺片、细胞爬片等。显微切割的应用：①细胞基因突变及微卫星变异的争论；②细胞基因拷贝数的变化和甲基化RT－PCR；④比较基因组杂交；⑤cDNA〔芯片。FISH的应用：①基因定位与基因制图；②基因诊断；③间期细胞遗传学FISH在肿瘤生物学中的应用：①肿瘤细胞遗传学；②基因定位；③病毒基因插入基因组局部的检测；④基因的扩增与缺失。蛋白质组〔proteome〕技术的组成、蛋白质组学的争论领域的组成及蛋白质组学在肿瘤争论中的应用：蛋白质组技术主要由蛋白质分别、蛋白质鉴定和生物信息学三局部组成。①用于蛋白质分别技术方面的有双向凝胶电泳(2DE)、双向“高效”柱层析等。②用于蛋白质鉴定的技术如质谱技术、凝胶图像分析、蛋白质和多肽的Ｎ端、Ｃ端测序及氨基酸组成分析等。③用于分析大量数据的生物工程信息学等。其中双向凝胶电泳(twodimensionalpolyacrylamidegels,2－D)和质谱技术(massspectrometry,MS)是蛋白质组学争论最重要的核心技术。3征争论;②差异显示蛋白质组学,即对肿瘤等疾病有广泛应用前景的蛋白质表达水平的比较;③应用质谱技术和酵母双杂交体系对蛋白质间相互作用的争论。蛋白质组学在肿瘤争论中的应用：①查找肿瘤特异标志物蛋白,建立并完善肿瘤蛋白质组数据库；②分子通路信号转导机制争论:蛋白质组技术也给细胞信号转导通路的争论带来的思路；③无创伤与早期诊断；④分类鉴定:通过蛋白质的变化对肿瘤进展分类也是蛋白质组学的重要用途之一；⑤推断预后；⑥选择药物靶标。三.典型试题举例及分析〔一〕选择题以下说法正确的选项是沿食管病灶同侧纵行剪开管壁。假设整个周径为病变累及，则沿最厚处剪开。假设病变位于胃大弯，则取材时沿胃小弯剪开。对送检的肠组织取材，假设不能确定病灶位置，则沿肠系膜附着缘的对侧剪开。肝癌标本，沿病灶最小径线切第一刀，假设病灶较大，则相距1～2cm作多个平行切面。以上都不是〔答案：B〕分析：对于食管的病变应沿病灶对侧纵行剪开管壁。假设整个周径为病变累及，则沿最薄处剪开；对于肠道病变沿病灶对侧剪开肠壁，假设不能确定病灶位置，则沿肠系膜附着缘剪开；对1～2cm胃脏标本正确的取材方法是：首先沿胃小弯剪开，然后观看病灶的位置取材。1－2cm一般沿胃大弯剪开，然后观看病灶的位置取材沿着胃脏的幽门或贲门随机剪开，找到病灶，然后随机取材。以上都不是〔C〕胃大弯，则沿胃小弯剪开。肝脏肿瘤标本正确的取材方法是首先分别分别左右肝叶然后随机在肿瘤中心松软处取材。沿肝脏最大长径间隔1－2cm平行切开，在肿瘤与非肿瘤交界处取材。沿肝脏横径随机切开，将病灶随机切成多个不规章碎块，任选取其中一块即可。细针穿刺是最好的取材方法。以上都不是。〔B〕1～2cm行切面。而肿瘤标本取材原则，应选肿瘤主体、肿瘤邻近组织及肿瘤两端的切缘〔假设管道器官〕分别取材，应留意切取肿瘤与正常组织交界处。细针穿刺穿刺到的是格外少的一点组织，B用电镜检查的标本用哪种固定液A10％福尔马林B70％酒精C95％酒精D4％戊二醛Ecarnoy〔答案：D〕分析：10％福尔马林、80％～95％浓度是单纯固定液，它们都可以用于固定大多数做常规切片的组织，但酒精作为固定剂不利于染色质的固定，要证明细胞内的脂肪、类脂质及色素存在的标本不能用酒精固定；95％酒精用于固定细胞涂片、刷片；70％酒精不用于固定标本；carnoyD4％戊二醛用于固定做电镜检查的标本。组织块取材的厚度以多厚为宜〔答案：A〕A0.2～0.3cmB1～1.5cmC2～3cmD任凭E按需要〔答案：A〕0.2～0.3cm1～1.5cm21cmx1cmx0.2cm以免铺张试剂。以下说法正确的选项是用于免疫组织化学的切片越大越好，以便观看对于皮肤、腔道器官及囊壁组织等取材应剪成细条即使组织块有血液等污物也不应用水冲洗，以免组织细胞特有的抗原丧失DE以上都不是〔答案：B〕1cmx1cmx0.2cm对于皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条，较长时可卷成同心圆状；取材时组织块如有血液、粘液、粪便等污物，先用水冲洗干净再取材；肿瘤标本取材，应选肿瘤主体、肿瘤邻近组织及肿瘤两端的切缘〔假设管道器官〕分别取材，应留意切取肿瘤与正常组织交界处；MassonA胶原纤维B网状纤维C淀粉样物质D脂肪E以上都不是〔答案：A〕分析：Masson三色染色法用于染胶原纤维；嗜银染色染网状纤维；刚果红或甲基紫用于显示III以下哪种特别染色有助于鉴别卵巢纤维瘤与膜细胞瘤AMassonB嗜银染色CPASDIIIE刚果红染色〔答案：D〕分析：膜细胞瘤内有黄色类脂区，瘤细胞内或瘤细胞间有类脂小滴，苏丹III染色这些类脂小滴呈橘红色；而卵巢纤维瘤则不会消灭这种状况。脂肪染色的标本应如何处理A无水乙醇固定B用冰冻切片或炭蜡包埋切片C10％的福尔马林D4％戊二醛E75％酒精固定〔B〕分析：脂质的抱负固定液是甲醛钙或中性缓冲甲醛，脂肪染色用冰冻切片或炭蜡包埋切片；酒精不能用于固定要证明细胞内的脂肪、类脂质及色素存在的标本；10％的福尔马林用于固HE4％戊二醛用于固定用于电镜检查的标本。用哪种特别染色可以显示淀粉样物质AIIIBCDEPAS〔D〕分析：苏丹III染色染脂肪；嗜银染色显示网状纤维；普鲁士蓝反响显示含铁的色素；刚果红或甲基紫显示淀粉样物质；PAS鼻咽癌组织应选哪种标记ACKBVimentinCLCADCgAECD68〔A〕分析：CKVimentinLCA标记淋巴细胞，可用于淋巴瘤的诊断、鉴别；CgA标记物，可用于神经内分泌肿瘤的关心诊断、鉴别：CD68为组织细胞标记物，可用于与组织细胞来源相关的疾病的关心诊断，如恶纤组等。AFP黑色素细胞瘤B乳腺癌C肝细胞癌D宫内膜癌E鼻咽癌〔C〕分析：肝细胞癌和内胚窦瘤的标记物为AFP；黑色素细胞的标记物为HMB45、S-100；ER、PR。以下哪组选项可以区分癌和肉瘤ACKEMABCKVimentinCCD68VimentinDEMACgAELCAGFAP〔B〕LCA〔淋巴细胞标记物CgA为神经内分泌标记物；GFAP为神经组织标记物。以下哪一项不是上皮性标记物ACKBEMACCEADmac387ECK19〔D〕分析：CK、EMA、CEA、CK19均为上皮性标记物；mac387为组织细胞标记物。现在最常用的免疫组织化学的方法是ASPABCCLSABDSABCEEnVision〔E〕分析：EnVision法是一高敏感性显色系统，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育，由于不再有二抗与三抗通过生物素结合，故整个系统不受内源性生物素的干扰，避开了非特异SP、ABC、LSAB、SABC有关免疫组织化学应用以下哪一项为哪一项正确的A免疫组织化学技术是鉴别良恶性肿瘤的有效方法之一B．免疫组织化学技术应用对肿瘤的预后没有帮助C．免疫组织化学技术是帮助区分组织学来源的有效方法之一D．免疫组织化学技术还可以确定肿瘤的临床分期E．以上都不是〔C〕分析：免疫组织化学主要检测细胞内或细胞间的正常或特别物质，以确定某些肿瘤的组织发生及类型，以及估价免疫损伤性疾病的性质、发病机制和预后。肿瘤的临床分期主要是依据TMN法：原位肿瘤大小、有无远处转移、有无淋巴结转移。免疫组织化学不能确定肿瘤的临床分期。透射式电镜要求切片的厚度A30－60nmB130－160nmC200nmD没有严格的要求E越薄越好〔A〕分析：透射式电镜主要用于观看细胞内部的微小构造，检查组织要求超薄切片，即切片的厚50nm100nm。以下说法不正确的选项是A组织芯片体积小、信息含量大，可依据不同需要进展组合和设计BC显微切割技术用于切割的材料可以是冰冻组织切片、细胞涂片、细胞铺片、细胞爬片等，但不能是石蜡切片DE激光共聚焦扫描显微镜可在观看培育细胞形态构造的同时，直接显示活体细胞内的代谢变化〔C〕分析：显微切割技术用于切割的材料可以是冰冻组织切片、细胞涂片、细胞铺片、细胞爬片等，也可以是石蜡切片。ConfocallaserscanningmicroscopyA可在观看培育细胞形态构造的同时，直接显示活体细胞内的代谢变化形态学争论从平面图像水平提高到三维立体水平，图像清楚明媚可利用计算机及图像处理系统对组织、细胞及亚细胞构造进展断层扫描，再现三维立体空间构造以上皆不是〔A〕分析：Confocallaserscanningmicroscopy可在观看培育细胞形态构造的同时，直接显示活体细胞内的代谢变化等。FISH在肿瘤生物学中的应用A肿瘤细胞遗传学BC病毒基因插入基因组局部的检测D基因的扩增与缺失E以上都是〔E〕分析：FISH在肿瘤生物学中的应用包括：①肿瘤细胞遗传学；②基因定位；③病毒基因插入基因组局部的检测；④基因的扩增与缺失。〔二〕名词解释：活体组织检查冰冻切片快速诊断比较基因组杂交技术〔CGH〕HE基因芯片荧光原位分子杂交染色体分析技术〔FISH〕蛋白质组学细胞学检查名词解释答案参考根本概念〔三〕简答题简述淋巴结活检要留意的事项。进展冰冻切片检查的原则。简述组织取材的一般原则。最常用于固定病理活检标本的是哪种固定液？如何配制？网状纤维染色即嗜银染色在肿瘤病理诊断中的作用。简述在免疫组化染色前为何要对组织切片进展抗原修复。蛋白质组学在肿瘤争论中有何应用？简述免疫组织化学的作用。简述FISH简述组织芯片的特点。答案及分析：1.①有多组淋巴结肿大，避开取腹股沟淋巴结，由于这组淋巴结的慢性非特异性炎症和纤维化最常见，形态背景简洁，不利于特异性病变的诊断；②同一个区域有多个淋巴结肿大，避开福尔马林固定，勿用酒精；⑤固定前要将淋巴结切开。活检时，不能在取出小块组织后就匆忙关腹，须待冰冻报告见到病变组织才能关腹。0.2～0.3cm1～1.5cm21cmx1cmx0.2cm为好，以免铺张试剂；②对于皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条，较长时可卷成同心圆状；③骨组织需先经过脱钙处理；④组织块如有血液、粘液、粪便等污物，先用水冲洗干净再取材；⑤肿瘤标本取材，应选肿瘤主体、肿瘤邻近组织及肿瘤两端的切缘分别取材，应留意切取肿瘤与正常组织交界处；⑥颖组织需保存时，应用锡箔纸包好，快速过液氮，于－70O答案：10％福尔马林；配制：1409①区分上皮性和非上皮性肿瘤，在恶性上皮性肿瘤的癌巢四周可见网状纤维，在肉瘤则是银染阳性的物质分隔单个瘤细胞；②推断原位癌与早期浸润癌，前者基底膜完整，后者基底膜断裂崩解。经甲醛液固定、石蜡包埋的组织，其组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联，使组织中抗原的打算簇被封闭，抗体难以和抗原充分结合。因此需要对组织切片进展抗原修复，目的是翻开组织抗原蛋白与甲醛的交联，暴露组织抗原，以提高组织抗原的检出率。①查找肿瘤特异标志物蛋白,建立并完善肿瘤蛋白质组数据库；②分子通路信号转导机制选择药物靶标。①显示组织切片内是否存在某种抗原；②显示该抗原存在于组织或细胞的部位；③在同等染色条件下，通过比较阳性细胞的数量或强度，可作半定量分析。原理：是应用荧光标记物标记碱