荆防颗粒的现代研究

荆防颗粒的现代研究

京防散是现代的中药制剂。这种经典的中药制剂来自宋代的太平惠民和宋府。它是通过添加或减少人参的毒散而成的。它由五种中药组成：芥末、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川药、栀子、桔梗和甘草。它具有出汗、缓解、驱风、除湿的功效。主要用于外感风、感冒和外感病原体，在寒风外感的情况下被广泛使用。2020年新型冠状病毒肺炎暴发以来，荆防败毒散/荆防颗粒亦被推荐为治疗药物，疗效得到众多医家认可，为其功效主治提供了丰富的临床支撑1材料和方法1.1胡、茯苓、甘草、植物、羌活、独活荆防颗粒（组方包括荆芥、防风、柴胡、前胡、茯苓、枳壳、甘草、桔梗、川芎、羌活和独活），山东新时代药业有限公司，国药准字Z37020357，批号0012004006，规格15g/袋。1.2实验动物：中方g无特定病原体（SPF）级昆明（KM）小鼠，雌雄各半，体质量（18~22）g，购于北京斯贝福实验动物有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0010。动物饲养于成都中医药大学药学院动物观察室，许可证号SYXK（川）2020-124。本实验符合动物实验伦理学标准，并得到成都中医药大学实验动物伦理委员会的批准。1.3品有限公司生产品56°红星二锅头（北京红星股份有限公司，生产日期20191204）；无水乙醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号202010140）；二甲基亚砜（分析纯，成都市科隆化学品有限公司，批号202090701）；甲醛溶液（成都市科隆化学品有限公司，批号2019011001）；GAPDHRabbitmAbPI3KRabbitmAb（货号GB11002、GB11525）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；AktRabbitmAb、p-PI3KRabbitmAb、p-AktRabbitmAb（货号C67E7、17366S、4060S）购自CellSignalingTechnologies公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号P0012）、RIPA裂解液（货号P00138）购自上海碧云天公司。1.4upt-2-tm超纯水仪Agilent7890A气相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；MDF-U50V超低温冰箱（Sanyo，日本）；UPT-2-5T超纯水仪（成都优普电子产品有限公司）；KZ-II高效组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；ST16R低温高速冷冻离心机（ThermoScientific公司)；DYY-6C型电泳仪电源(北京市六一仪器厂)；Bio-RadChemiDocXRS+化学发光成像系统（Bio-Rad）；ImageLab凝胶分析系统(Bio-Rad)。1.5抗癫痫药物产品及其相应目标的数据库建设在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）1.6有关解酒和肝脏保护的目标建立在CTD数据库1.7荆防颗粒失效成分靶点与解酒保肝靶点的安装在Venn在线作图网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中分别粘贴荆防颗粒药效成分靶点和解酒保肝相关靶点，得到交集靶点Venn图。1.8交付点的盟度分析运用STRING1.9关键目标点的器官定位将筛选后的核心靶点信息导入BioGPS数据库1.10kagg路径分析通过Metascape1.11网络建设运用Cytoscape3.8.0构建荆防颗粒药味-交集靶点-富集通路网络。1.12分子定位综合1.8和1.11结果，确定进行分子对接的关键药效成分和靶点蛋白。将靶点信息对应的UniProtID输入PDB数据库1.13id法提取肝组织总蛋白取SPF级健康KM小鼠，雌雄各半，适应性喂养3d后，将小鼠按体质量分层随机分为空白组、模型组和荆防颗粒高、低剂量组（15、10.5g·kg采用气相色谱法检测小鼠血清乙醇含量，二甲基亚砜制备上机测定样品。气相色谱条件：进样口温度220℃；FID检测器温度220℃；色谱升温程序70℃(保留5min)，35℃·min采用RIPA裂解液提取肝组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，调等浓度后，加上样缓冲液使蛋白变性。80V恒温电泳30min，转100V恒压电泳1h，100V恒压转膜120min，用5%BSA溶液封闭90min，加入一抗PI3K（1：1000）、Akt（1：1000）、p-PI3K（1：1000）、p-Akt（1:1000）和内参GAPDH（1:2000）4℃孵育过夜，洗膜3次，每次10min，加入二抗HRP（1:5000）孵育90min，再次洗膜后在显影成像仪中显色曝光，条带用ImageLab6.0.1软件进行分析。1.14统计分析采用统计软件SPSS26.0进行实验数据统计，以2结果2.1荆防颗粒分次结果分析根据TCMSP数据库查询结果和筛选条件，得到荆防颗粒11味中药共有220个成分，去重整理后得到187个成分。具体成分及化合物分类见图1。荆防颗粒药效成分主要为黄酮类、香豆素类、萜类、甾醇类和色原酮类化合物，其中甘草的特有化学成分最多，其次为茯苓、前胡、柴胡、防风等。甘草中独有的化学成分最多（87个），荆防颗粒组方中君药荆芥、防风的独有成分个数分别为4、11个；黑色圆点连线表示多个药味共有成分。此外187个成分中能找到对应靶点的成分有172个，筛选后得到潜在成分靶点469个，其中包括共有成分靶点115个，去重整理后得到152个靶点信息。2.2alcoho不同在疾病基因中的表达在CTD数据库“Diseases”检索“liver”，得到“liverdiseases，alcoholic”，其MeSHID为DOO8108，包括其后续疾病基因一共得到53477个疾病基因，去重后得到19930个基因信息。其中明确具有“directevidence”的基因有39个；计算“inferencescore”中位数，并以6倍中位数筛选后得到基因信息1088个。2.3荆防颗粒与解酒保肝相关性分析将荆防颗粒对应的152个靶点信息和解酒保肝1127个基因信息分别导入在线作图工具后，可以发现荆防颗粒药效成分对应的靶点中，超过30%的靶点与酒精性肝病对应靶点相同，说明荆防颗粒与解酒保肝具有一定相关性。2.4固碳分析GO分析是为了研究所涉及靶点基因参与的BP、CC和MF2.5核心靶点在肝脏中的表达分析为进一步明确核心靶点在荆防颗粒解酒保肝中的作用，采用核心靶点器官定位，对其在肝脏中的表达情况进行初步了解。核心靶点在肝脏中均有良好的表达情况（大于中位数被认为其在肝脏中表达良好），见表1。其中AKT1在肝脏中的表达情况远远大于中位数，提示AKT1是荆防颗粒解酒保肝的重要靶点之一。2.6src、esr1、mmp9的deg相对于现代网络见图1通过对药效成分和疾病交集靶点进行蛋白互作分析发现，AKT1、EGFR、PTGS2、SRC、ESR1、MMP9的degree较大（以degree2倍中位数为筛选标准）。并按颜色由深到浅，圆圈和字号由大到小形成网络，见图3。蛋白节点和字号越大、颜色越深，表明其重要性越大，结合GO富集分析结果，提示AKT1、EGFR可能是荆防颗粒发挥解酒保肝作用的重要靶点。2.7荆防颗粒活性成分信息将药物成分和靶点导入Cytoscape3.8.0后，得到网络节点225个，节点间相互关系811个，按betweennesscentrality（BC）大小进行节点调整，发现quercetin是共有成分中最主要的成分；经过活性成分筛选和对应靶点筛选后，甘草活性成分和对应靶点最多。将2.6项核心靶点代入已建立的荆防颗粒成分靶点信息库发现，除羌活外，荆防颗粒其余组方药材活性成分中均有成分对应核心靶点，其中与PTGS2对应的活性成分最多，ESR1次之；并且防风和甘草中对应核心靶点的成分最多，荆芥、独活、前胡次之；同时AKT1和EGFR仅是共有成分槲皮素与其对应。因此推测槲皮素以及防风、甘草的活性成分可能是荆防颗粒发挥解酒保肝作用的重要成分。在KEGG通路分析结果中按log2.8pynol2.2添加总靶点分子的分子数据根据degree大小进行选择并结合2.4和2.7项的结果，选择quercetin、5-根据结合能结果选择与各成分结合能最低的2个蛋白导入PyMOL2.2进行可视化，代表成分与主要靶点分子对接示意图见图5~8。图中红色区域是配体小分子，绿色区域为蛋白大分子，紫色区域是与配体小分子结合的氨基酸残基，黄色虚线部分是该氨基酸残基与配体小分子间的距离。可以发现各成分与靶点蛋白间均能形成氢键，且氢键长度（氨基酸残基与配体小分子间的距离）较短，表明两者间亲和力良好。且分子对接和最佳对结构象分析均表明荆防颗粒的活性成分与临床常用的保肝药物有相似表现，为后续研究提供了一定理论支撑。2.9避免使用这种方法，防止小鼠血清中乙醇含量波动与空白组相比，小鼠灌胃白酒后60min，模型组小鼠血清乙醇含量显著升高（2.10p-pi3k、akt、akt比值对小鼠肝组织pi3k、p-akt表达的影响小鼠肝组织Westernblot实验结果表明，与空白组比较，模型组小鼠肝组织中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值下调，提示该通路的抑制；与模型组相比，荆防颗粒2个剂量组对此下调均有一定拮抗表现，其中以上调p-PI3K/PI3K蛋白表达比值作用显著（3荆防颗粒解酒保肝作用研究结论自20世纪60年代以来，酒精性肝病（ALD）研究一直为研究热点，实验模型证明酒精是肝毒素，可引起肝细胞损伤，也证明ALD并非仅由营养不良引起本研究通过网络药理学分析获得与荆防颗粒解酒保肝作用相关的5种关键活性成分（quercetin、5-GO和KEGG通路分析发现，作用靶点主要富集在活性氧、氧化应激、蛋白激酶活性和PI3K-Akt信号通路等方面。其中，PI3K-Akt信号通路能调控氧化还原平衡中的许多关键靶标本研究采用小鼠醉酒模型初步验证荆防颗粒的解酒保肝作用，结果表明荆防颗粒能显著降低模型小鼠血清乙醇含量，同时上调模型小鼠肝组织PI3K、Akt的磷酸化表达，使P-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值上调，提示荆防颗粒解酒保肝作用与激活PI3K-Akt信号通路有关，该结果初步验证了网络药理学的预测，亦与一些文献报道相吻合综上，本研究运用网络药理学与分子对接方法，对荆