新教材生物一轮复习课件：第10单元 生物技术与工程 第7讲　基因工程的基本操作程序和蛋白质工程(共100张PPT)

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第7讲基因工程的基本操作程序和蛋白质工程

新教材生物一轮复习

01

考点研析·重难突破

考点一基因工程的基本操作程序

1.目的基因的筛选与获取

（1）筛选合适的目的基因

①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。

②筛选目的基因的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

受体细胞性状

预期表达产物

编码蛋白质

结构和功能

（2）利用PCR获取和扩增目的基因

提醒①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。

②引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。

（3）通过构建基因文库获取目的基因。

基因文库

2.基因表达载体的构建

（1）构建基因表达载体的目的

①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

②使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）基因表达载体的组成

稳定存在

遗传

表达

（3）基因表达载体的构建过程

3.将目的基因导入受体细胞

提醒导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。

4.目的基因的检测与鉴定

1.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（选择性必修3P77相关信息）（√）

2.构建基因表达载体是转基因工程的核心工作。（选择性必修3P80正文）（√）

3.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动DNA的复制过程。（选择性必修3P80正文）（×）

4.将生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞中，就可获得具有理想性状的转基因植物。（选择性必修3P80旁栏思考）（×）

5.转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（选择性必修3P81资料卡）（√）

6.Ti质粒上的T－DNA可携带目的基因进入宿主细胞，并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA中。（选择性必修3P81资料卡）（√）

√

√

×

×

√

√

1.（选择性必修3P77正文）利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？

提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向（模板链的3'端）开始，所以引物的碱基序列是不同的。

2.（选择性必修3P80正文）为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？

提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。

3.（选择性必修3P81正文）在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？

提示：Ti质粒上的T－DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。

1.启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别

位置作用

启动子位于DNA分子上RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程

起始密码子位于mRNA分子上决定翻译的开始

终止子位于DNA分子上决定转录的结束

终止密码子位于mRNA分子上决定翻译的结束

2.标记基因的作用：标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞

结合PCR技术的操作和应用，

考查科学思维能力

1.PCR反应中使用的引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基，而5'端则无严格限制，常用于给目的基因两侧添加限制酶切点等序列。下列相关叙述正确的是（）

A.PCR第3个循环，消耗了7对引物

B.反应体系中游离的脱氧核苷酸作为PCR扩增的原料会依次连接到引物的5'端

C.耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸结合到双链DNA片段的引物链上

D.用图中引物扩增仅需2个循环后就能获得两端均添加限制酶切点的目的基因

解析：C该DNA是双链，第一次循环需要1对引物，第二次需要2对，第三次需要4对，第四次需要8对，即PCR第3个循环，消耗了4对引物，A错误；进行PCR时，扩增是从引物的3'端延伸，因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3'端，B错误；耐高温的DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上，C正确；由图示可知，第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即用图中引物扩增至少3个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的基因，D错误。

2.如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（）

A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端

B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段

C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因

D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占15/16

解析：D由于复制过程中子链的合成方向是从5'端向3'端，所以耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端，A正确；图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此复制出的子链的长短从引物开始一直延伸至模板链的末端，在第二轮复制中才会出现两个引物之间的单链，因此以此单链为模板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，B正确；如果引物之间或引物自身发生碱基互补配对则会降低与模板链结合的效率，因此不能有效扩增目的基因，C正确；第三轮扩增共形成8个DNA分子，共16条链，除去原来的模板链，应该有新形成的14条链，且这14条链中均含有引物，两种引物使用的频率是相同的，即有7条单链含有引物A，每一条单链参与组成1个DNA分子，因此第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占7/8，D错误。

围绕基因工程的基本操作程序，

考查科学思维能力

3.人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）缺乏症

是一种常染色体隐性遗传病，患者因

缺乏hGC基因而不能合成hGC，导致

脾脏肿大、梗死和破裂，所以通常活

不过10岁。传统的治疗方法是从人的胎盘中提取hGC后注入人体，治疗价格十分昂贵。科学家现已将hGC基因通过农杆菌转化法成功转入烟草中，并高效表达，其过程如图所示。下列说法正确的是（）

A.转化是指将hGC基因导入烟草细胞，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程

B.过程③一般采用显微注射将农杆菌导入烟草细胞

C.从含重组Ti质粒的农杆菌中获取hGC基因的表达产物可直接用于疾病治疗

D.从愈伤组织中提取蛋白质作为抗原进行抗原—抗体杂交检测hGC基因是否转录

解析：A转化是指将hGC基因导入烟草细胞，并且在烟草细胞内维持稳定和表达的过程，A正确；过程③一般采用含重组质粒的农杆菌感染烟草细胞，B错误；农杆菌属于原核生物，不含内质网和高尔基体，所表达的蛋白质还不具有相应的空间结构，没有活性，从含重组Ti质粒的农杆菌中获取hGC基因的表达产物需加工后才可用于疾病治疗，C错误；可从愈伤组织中提取蛋白质作为抗原进行抗原—抗体杂交检测hGC基因是否翻译，D错误。

4.基因工程是花卉培养中的一种重要技术手段，这能够培养出不少新品种的花卉。如图为利用矮牵牛花中编码3，5－羟氧化酶的基因（HE）改造玫瑰，培育能够产生蓝色花冠玫瑰的新品种的技术流程图。图中TetR、AmpR、NPTⅡ分别表示四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氨基糖苷类－3－磷酸转移酶基因。请分析回答下列问题：

（1）基因工程的核心步骤是。

解析：（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。

答案：（1）基因表达载体的构建

（2）从矮牵牛花细胞中获得目的基因后，对其扩增的技术叫，这种技术手段需要用到的一种特殊工具酶是。

解析：（2）对目的基因进行扩增的技术叫PCR，中文名是聚合酶链式反应。因为该技术在较高的温度下进行，因此需要用到一种特殊的工具酶，即耐高温的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶。

答案：（2）PCRTaqDNA聚合酶（或耐高温的DNA聚合酶）

（3）根据图示分析，为了便于后期筛选成功导入大分子A的农杆菌，选择的限制酶的种类是，限制酶的作用是。

解析：（3）为了防止破坏目的基因，不能选择限制酶BamHⅠ，应选择限制酶SalⅠ，但会破坏TetR，为了保留AmpR不被破坏，故选择的限制酶的种类是EcoRⅠ和SalⅠ。限制酶的作用是识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子。

答案：（3）SalⅠ、EcoRⅠ识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子

（4）构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间，其中启动子的作用是作为酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类所需蛋白质。

解析：（4）启动子是一段特殊的DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，用于驱动基因的转录。

答案：（4）RNA聚合

（5）成功导入大分子A的农杆菌在含四环素培养基、含氨苄青霉素培养基、同时含两种抗生素的培养基上的生存状况应该是。

解析：（5）由于在该过程中四环素抗性基因被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常，故成功导入大分子A的农杆菌在含四环素培养基、

答案：（5）能在含氨苄青霉素的培养基上生存，但是不能在含四环素培养基和同时含两种抗生素的培养基上生存

（6）检测HE是否成功插入到染色体DNA上，检测方法是采用。

解析：含氨苄青霉素培养基、同时含两种抗生素的培养基上生存状况应该是能在含氨苄青霉素的培养基上生存，但是不能在含四环素培养基和同时含两种抗生素的培养基上生存。（6）可采用PCR技术检测目的基因是否成功插入到宿主细胞的染色体DNA上。

答案：（6）PCR技术

农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。

考点二DNA片段的扩增及电泳鉴定

1.实验基础

2.PCR实验操作步骤

3.DNA的电泳鉴定

1.DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？

提示：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。

2.若操进行电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。

提示：不止一条条带的原因：操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或含有其他DNA片段，以此为模板，进行了扩增。

围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，

考查科学探究能力

1.（2023·湖北高考）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（）

A.增加模板DNA量B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间D.提高复性的温度

解析：D增加模板DNA的量可以提高反应速率，但不能有效减少非特异性条带的产生，A不符合题意；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带的产生，B、C不符合题意；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D符合题意。

2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA，3～9号的模板为转基因植株的DNA，10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出的分析不合理的是（）

A.PCR产物的分子大小在250至500bp之间

B.3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达

C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株

D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰

解析：BPCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500bp，A合理；3号PCR结果包含250～500bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B不合理；9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对实验结果的干扰，D合理。

考点三基因工程的应用及蛋白质工程

1.基因工程的应用

（1）基因工程的一般应用

（2）乳腺生物反应器

提醒乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，乳腺生物反应器是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。

2.蛋白质工程的原理和应用

（1）蛋白质工程的概念

（2）蛋白质工程的基本原理

（3）蛋白质工程的应用

①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。

②其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。

③农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。

酶

工业用酶

参与调控光合作用的酶

蛋白质的结构

1.外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快。（选择性必修3P89正文）（√）

2.干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛应用。（选择性必修3P90资料卡）（√）

3.用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。（选择性必修3P91相关信息）（√）

4.蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。（选择性必修3P93正文）（√）

5.蛋白质工程的应用为酶制剂产业的发展提供了强大助力。（选择性必修3P96到社会中去）（√）

√

√

√

√

√

1.（选择性必修3P90正文）生产乳腺生物反应器构建基因表达载体时有什么特别要求？为什么？

提示：必须把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。因为只有连接了乳腺中特异表达的基因的启动子，才能保证在雌性动物泌乳期相应的目的基因在其乳腺细胞内得以表达。

2.（选择性必修3P94正文）对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？

提示：应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。

借助基因工程的应用，

考查科学思维和社会责任

1.下列生物技术操作对遗传物质的改造，不能遗传给子代的是（）

A.将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌，筛选获得的基因工程菌

B.通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株

C.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗

D.将生长激素基因导入奶牛受精卵，培育出能分泌含生长激素乳汁的奶牛

解析：C将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌，筛选获得的基因工程菌可以通过二分裂的方式遗传给子代，A不符合题意；通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株，遗传物质发生改变，可以通过无性繁殖遗传给子代，B不符合题意；将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后，只是淋巴细胞含有这个基因，其生殖细胞没有该基因，因此不能遗传给子代，C符合题意；将生长激素基因导入奶牛受精卵，受精卵含有生长激素基因，受精卵培育成的奶牛含有该基因，因此可以遗传给子代，D不符合题意。

2.普通番茄细胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶（简称PG），PG能破坏细胞壁使番茄软化不耐储藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。如图表示抗PG基因的作用原理，下列有关叙述正确的是（）

A.该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是抗PG基因能阻止PG基因表达的转录过程，使细胞不能合成PG

B.采用PCR技术将抗PG基因进行体外扩增时，在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要逆转录酶

C.将抗PG基因插入Ti质粒的T－DNA上构建基因表达载体

D.若将抗PG基因导入细胞核，可避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”

解析：C据题图可知，抗PG基因与PG基因转录成的mRNA正好相互结合，阻止了PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG，A错误；PCR过程所需要的条件有：模板、引物、原料、TaqDNA聚合酶，B错误；将抗PG基因插入Ti质粒的T－DNA上构建基因表达载体，C正确；花粉中的雄配子几乎不含质基因，所以为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入细胞质，D错误。

围绕蛋白质工程，考查科学思维能力

3.为心梗患者注射大剂量的t－PA（一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分泌并释放进血液）会诱发颅内出血。研究证实，将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，据此分析下列叙述错误的是（）

A.若利用大肠杆菌来生产t－PA，需要对其合成的t－PA进行后期改造

B.改造t－PA的技术属于蛋白质工程

C.欲将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应直接对蛋白质（t－PA）进行改造

D.可利用抗原—抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t－PA

解析：C由于大肠杆菌只有核糖体一种细胞器，不含内质网和高尔基体，无法对t－PA进行加工，故若利用大肠杆菌来生产t－PA，需要对其合成的t－PA进行后期改造，A正确；分析题意可知，本技术是将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，属于蛋白质工程，B正确；欲将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应对相应的基因进行改造，C错误；t－PA是一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故可利用抗原—抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t－PA，D正确。

4.如图表示蛋白质工程的操作过程，下列相关叙述错误的是（）

A.图中a、b分别表示复制和转录

B.蛋白质工程能定向改造蛋白质分子结构

C.蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称为第二代基因工程

D.蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子

解析：A由图分析可知，过程a、b分别是转录、翻译，A错误；蛋白质工程能按照人们的意愿定向改造蛋白质分子结构，B正确；蛋白质工程与基因工程密不可分，是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程技术，C正确；蛋白质工程通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，可见蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子，D正确。

02

真题体验·感悟高考

从科学思维角度，考查基因工程

的操作和应用

1.下列关于基因工程的叙述，正确的是（）

A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定

B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关

C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA

D.已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置

解析：D若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则该限制性内切核酸酶可能会切割重组质粒，破坏重组质粒的结构，A错误；抗除草剂基因转入某抗盐植物后，一部分抗盐植株的抗盐性消失，说明抗除草剂基因的转入可能导致抗盐性改变，B错误；抗除草剂基因转入某植物后，若DNA检测含有目的基因，而抗性鉴定为不抗除草剂，其原因可能是目的基因转录出RNA但无法翻译，也可能是目的基因无法转录，还可能是翻译出来的蛋白质无活性，C错误；若环状质粒上有1个某种限制性内切核酸酶的酶切位置，则该环状质粒被该酶酶切后形成1个条带，若要形成2个条带，则该环状质粒上至少有2个该酶的酶切位置，若要形成3个条带，则该环状质粒上至少有3个该酶的酶切位置，D正确。

2.（2023·江苏高考）如图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（）

A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列

B.该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上

C.若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组

D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异

解析：D农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T－DNA序列，A正确；该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型的细胞，其中包括只含有目的基因的、只含有标记基因的和既含有目的基因又含有标记基因的，C正确；由图可知，获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。

3.（2022·山东高考）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。

（1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的（填“3'端”或“5'端”）。

解析：（1）引物是小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此通过PCR特异性扩增P基因的引物，需要满足的条件是能与P基因母链3'端碱基序列互补配对，且为短单链核苷酸；DNA合成时，新链的延伸方向是5'→3'，引物是人为添加的，因此需要在5'端加上酶切位点以保护目的基因。

答案：（1）能与P基因母链3'端的碱基序列互补配对，短单链核苷酸5'端

（2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是。

修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是。

注：DNA编码链为转录时所用模板链的互补链。

解析：（2）融合基因转录出的mRNA序列正确，由图甲可知，GAATTC是引入引物5'端的，在最外侧，刚好对应2种密码子。如果从GAATTC对应的密码子开始读取，后面刚好接上P基因的编码链，因此很可能是P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码了一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。在修改扩增P基因时，在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端右侧添加1个碱基可解决该问题。

答案：（2）P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸导致mRNA的密码子被错位读取在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基

（3）融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是。

注：“＋”表示有，“－”表示无。

解析：（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是增强FLAG－P与UBC的结合；②④组未添加药物A，两组的差异在于添加FLAG－P或FLAG－P△，③⑤组添加了药物A，两组的差异也在于添加FLAG－P或FLAG－P△；结合图丙可知，②③组使用FLAG－P，出现杂交带，④⑤组使用FLAG－P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是参与P基因与UBC结合的关键序列。

答案：（3）增强FLAG－P与UBC的结合参与P基因与UBC的结合

（4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是。

解析：（4）根据以上分析推测，药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。

答案：（4）药物A通过增强P基因与UBC的结合，从而促进蛋白P的降解

从科学思维角度，考查蛋白质工程

4.（2023·辽宁高考）腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域，但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述错误的是（）

A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一

B.加入连接肽需要通过改造基因实现

C.获得N1的过程需要进行转录和翻译

D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合，再置于高温环境

解析：D在腈水合酶（N0）的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），则N1与N0氨基酸序列有所不同，这可能是影响其热稳定性的原因之一，A正确；蛋白质工程的作用对象是基因，即加入连接肽需要通过改造基因实现，B正确；N1为蛋白质，蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程，C正确；酶具有高效性，检测N1的活性需先将其置于高温环境，再与底物充分混合，D错误。

5.（2022·湖南高考）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：

（1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是，物质b是。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是。

解析：（1）天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，而蛋白质工程却与之相反，它的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，因此图中的物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA，在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象相同的原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。

答案：（1）氨基酸序列多肽链mRNA密码子具有简并性

（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有、和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是。

解析：（2）基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增；PCR技术遵循的基本原理是DNA的半保留复制。

答案：（2）从基因文库中获取目的基因通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成DNA的半保留复制

（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的（填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是。

解析：（3）由图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度的破坏。

答案：（3）种类提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度的破坏

（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。

解析：（4）该实验的目的是比较三种物质的抗凝血活性差异，实验设计思路为将等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别与同一种动物的等量血液混合，观察并记录血液凝固时间即可。

答案：（4）取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；酒精消毒后，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液分别加入3支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间

03

课后作业·巩固提升

一、选择题

酵母菌细胞壁的主要成分

是几丁质。酿酒酵母产酒精能

力强，但没有合成淀粉酶的能

力；糖化酵母能合成淀粉酶，但酒精发酵能力弱。科研人员通过两种途径改良酵母菌种，实现以淀粉为底物高效生产酒精的目的。下列叙述正确的是（）

A.途径Ⅰ需用纤维素酶处理酵母菌，再利用PEG诱导融合

B.途径Ⅱ需要以淀粉酶基因作为目的基因构建基因表达载体

C.途径Ⅰ和途径Ⅱ最终获得的目的酵母菌染色体数目相同

D.以淀粉转化为还原糖的效率作为最终鉴定目的菌的指标

解析：B途径Ⅰ需用几丁质酶处理酵母菌，再利用PEG诱导融合，A错误；根据题意，途径Ⅱ是将糖化酵母的淀粉酶基因提取出来，作为目的基因构建基因表达载体，从而获得目的酵母菌，B正确；途径Ⅰ获得的目的菌株为多倍体，是原来两种酵母菌染色体数目之和，途径Ⅱ获得的目的酵母菌染色体数目与原来酵母菌染色体数目相同，C错误；鉴定目的菌株的依据是酵母菌合成淀粉和酒精发酵的能力，D错误。

2.下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定原理的说法，正确的是（）

A.在一定的pH条件下，DNA分子可带上正电荷或负电荷

B.带电DNA分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相同的电极移动

C.DNA分子在凝胶中的迁移速率与DNA分子大小、构象等有关，与凝胶等无关

D.凝胶中的DNA分子直接可以在波长为300nm的紫外灯下被检测

解析：A在一定的pH条件下，DNA分子可带上正电荷或负电荷，从而能在电泳的条件下发生定向移动，A正确；带电DNA分子在电场的作用下会向着与它所带电荷相反的电极移动，B错误；DNA分子在凝胶中的迁移速率除了与DNA分子大小、构象等有关外，还与凝胶的浓度等有关，C错误；凝胶中的DNA分子需要经过染色，才能在波长为300nm的紫外灯下被显色检测，D错误。

3.玉米的赖氨酸含量比较低，科学家将合成赖氨酸的关键酶——天冬氨酸激酶中352位的苏氨酸变成异亮氨酸，二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬氨酸变成异亮氨酸后，可大大提高玉米中的赖氨酸含量。下列有关蛋白质工程的叙述正确的是（）

A.改造后的两种酶是自然界中已经存在的物质

B.在分子水平上直接对两种酶的氨基酸进行改造

C.蛋白质工程不需要从预期蛋白质功能出发，可直接设计其结构

D.蛋白质工程的目的是获得满足人类生产和生活需求的蛋白质

解析：D蛋白质工程崛起就是因为基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，而蛋白质工程可以产生新的蛋白质，A错误；由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，B错误；蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，C错误；蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，D正确。

4.为评估外源基因Vgb在菊花中的稳定性以及对生态环境的影响，研究人员在种植转基因菊花的第二年，随机选取转基因菊花株系及周边非转基因菊花和各种杂草，提取DNA。根据Vgb基因设计特异性引物进行PCR扩增，电泳结果如图。下列说法不正确的是（）

注：CK表示质粒阳性对照，1为空白对照，2～10为转基因菊花株系，11～15为不同种类杂草，16～20为非转基因菊花。

A.设置空白实验是为了排除实验操作、试剂污染等对结果的影响

B.结果表明2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定，且未发生向周边植物的扩散

C.转基因植物与周边其他植物之间不可能通过花粉发生基因交流

D.将Vgb基因转入其他植物时同样要经过安全性评价

解析：C设置空白实验是为了排除实验操作、试剂污染等对结果的影响，能提高实验的准确度，A正确；2～10为转基因菊花株系，均检测到外源基因Vgb，11～15为不同种类杂草，均未检测到外源基因Vgb，16～20为非转基因菊花，均未检测到外源基因Vgb，说明2年内Vgb基因在菊花细胞中稳定，且未发生向周边植物的扩散，B正确；实验结果不能证明转基因植物与周边其他植物之间没有通过花粉发生基因交流，可能存在其他植株将花粉传给转基因植株的现象，在转基因植物上也能检测到外源基因Vgb，C错误；将外源基因Vgb转入其他植物时同样要经过安全性评价，D正确。

5.玫瑰人工栽培历史悠久，迄今已培育出2500多个品种。玫瑰没有生成蓝色翠雀花素所需的黄酮类化合物3，5－氢氧化酶的基因，因此蓝玫瑰被认为是不可能培育成功的。科研人员将蓝三叶草中的蓝色素基因植入普通玫瑰而成功培育出了蓝玫瑰，这种玫瑰的花瓣中所含的色素为蓝色。下列叙述正确的是（）

A.蓝色翠雀花素分布于蓝玫瑰花瓣细胞的液泡中

B.培育蓝玫瑰用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体

C.蓝色素基因在所有玫瑰细胞中都能控制合成蓝色翠雀花素

D.科研人员必须将蓝色素基因导入普通玫瑰的卵细胞或受精卵才能获得可遗传的蓝玫瑰

解析：A蓝色翠雀花素分布于蓝玫瑰花瓣细胞的液泡中，叶绿体中不含该色素，A正确；培育蓝玫瑰用到的工具酶是限制酶和DNA连接酶，载体是基因工程常用的工具，但不是工具酶，B错误；由于基因的选择性表达，蓝色素基因只在玫瑰花瓣中控制合成蓝色翠雀花素，C错误；将目的基因导入植物体细胞，再采用植物组织培养技术也可获得可遗传的蓝玫瑰，D错误。

6.2022年3月8日下午，首位接受猪心脏移植的患者去世，虽然只存活了两个多月但该手术仍被视为医学重大进展。将经过基因改造的猪心脏移植到人体内，该手术为全球首例，并且在手术后最关键的48小时内并未发生任何异常，这为解决人体移植器官短缺的问题带来了曙光。下列说法错误的是（）

A.与猪相比，灵长类动物体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少

B.基因改造的猪心脏可能导入了某种调节因子抑制抗原决定基因的表达

C.基因改造过程中可能用到了限制酶、DNA连接酶

D.器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题

解析：A由于猪与人类的亲缘关系比灵长类远，因此与灵长类动物相比，猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少，因此猪更适合用于解决人类移植器官短缺的问题，A错误；科学家还试图利用基因工程技术对猪的器官进行改造，如设法导入了某种调节因子抑制抗原决定基因的表达，再结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官，B正确；基因改造过程涉及基因工程技术，因此可能会用到限制酶和DNA连接酶，C正确；器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题，因此克隆出避免免疫排斥的器官是医学界的难题，D正确。

7.chlL基因是蓝细菌拟核DNA上控制叶绿素合成的基因。为研究该基因的控制机理，首先需要构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞。技术路线如图所示，下列对此描述正确的是（）

A.chlL基因的基本组成单位是核糖核苷酸

B.①②过程中使用限制酶的作用是使DNA分子中氢键断裂

C.①②过程都要使用DNA聚合酶

D.若操作成功，可用含红霉素的培养基筛选出该变异株

解析：DchlL基因的本质是DNA，所以基本组成单位是脱氧核苷酸，A错误；限制酶的作用是将质粒和目的基因中的磷酸二酯键断开，B错误；①②过程都要使用限制酶和DNA连接酶，C错误；若操作成功，在无chlL基因的蓝细菌中含有红霉素抗性基因，因此能够用含红霉素的培养基筛选出该变异株，D正确。

8.将雪花莲凝集素基因（GNA）与尾穗苋凝集素基因（ACA）首尾相接得到融合基因GNA－ACA，将融合基因GNA－ACA与载体（pBI121）结合得到重组载体，再将重组载体导入棉花细胞获得抗蚜虫棉花新品种，如图所示。下列相关叙述错误的是（）

A.获得GNA－ACA融合基因需要用到限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶

B.最好用限制酶KpnⅠ和XhoⅠ切割DNA来获得重组载体

C.卡那霉素抗性基因作为标记基因，可将转基因棉花细胞筛选出来

D.GNA－ACA融合基因中游离磷酸基团的数量与pBI121的一样多

解析：D由图可知，GNA、ACA都含有限制酶BsaBⅠ的酶切位点，故用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，A正确；用KpnⅠ和XhoⅠ共同处理融合基因和质粒可分别获得两个不同的末端，在DNA连接酶的作用下，将融合基因和载体正向连接，同时也能避免载体和融合基因的自身环化，B正确；利用含卡那霉素的培养基能筛选出抗卡那霉素的细胞，所以用卡那霉素抗性基因作为标记基因，可将转基因棉花细胞筛选出来，C正确；GNA－ACA融合基因是链状，有2个游离的磷酸基团；pBI121是环状的，有0个游离的磷酸基团，D错误。

9.（不定项）农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列相关叙述正确的是（）

A.PCR技术依据的原理是DNA半保留复制

B.PCR技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶

C.选择图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列

D.通过与受体细胞的基因组序列比对来确定插入位置

解析：ACDPCR扩增技术全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，依据的原理是DNA的半保留复制，A正确；PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶，但不需要解旋酶，高温下DNA双螺旋可以打开，B错误；DNA的两条链反向平行，子链从引物的3'端开始延伸，利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C正确；通过与受体细胞的基因组序列比对，即可确定T－DNA的插入位置，D正确。

10.（不定项）科学家将常年生活在寒带的比目鱼中的抗冻基因转移到西红柿里，培育出了抗冻番茄，这种西红柿可以在冬季或较寒冷的地区种植，使得人们一年四季都能吃到西红柿。如图为含抗冻基因的外源DNA和质粒DNA的有关信息，其中EcoRⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、XhoⅠ均为限制酶，下列叙述中错误的是（）

A.构建基因表达载体时，应用EcoRⅠ和XhoⅠ分别切割抗冻基因和质粒

B.通过构建基因表达载体，可使目的基因在受体细胞中稳定存在

C.导入抗冻基因的番茄细胞能在含四环素和卡那霉素的培养基上形成愈伤组织

D.可以将转基因番茄种在寒冷条件下，以便筛选出具有抗冻性状的番茄植株

解析：AC据图可知，选择限制酶SalⅠ会破坏目的基因，故右端只能选择限制酶XhoⅠ，但该酶会破坏卡那霉素抗性基因，则应保证四环素抗性基因的完整性，则不能选择EcoRⅠ，故构建基因表达载体时，应选择用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ分别切割抗冻基因和质粒，这样既可以保护目的基因的完整性，也可以使质粒DNA上有完整的标记基因，A错误；通过构建基因表达载体，可使目的基因在受体细胞中稳定存在，B正确；由于基因表达载体上的卡那霉素基因已被破坏，故含有抗冻基因的番茄细胞并不具有卡那霉素的抗性，因此导入抗冻基因的番茄细胞不能在含卡那霉素的培养基上形成愈伤组织，C错误；可以将转基因番茄种在寒冷条件下，以便筛选出具有抗冻性状的番茄植株，该鉴定方法是个体生物学水平的鉴定，D正确。

二、非选择题

11.丙酮酸羧化酶（PEP）是控制油菜中蛋白质与油脂比例的关键酶。PEP反义基因是指反向连接在启动子之后的PEP基因，其在转录时的模板链为PEP基因模板链的互补链。PEP反义基因可抑制PEP基因的表达，从而提高油菜籽中的油脂含量。图甲为某种质粒的结构，其中npt－Ⅱ为新霉素抗性基因，gus基因控制合成的酶能使β－葡萄糖苷酸水解为蓝色物质，图乙为PEP基因的结构。回答下列问题。

（1）利用PCR技术扩增PEP基因时，需加入作为原料。在PCR反应缓冲液中还要加入Mg2＋，其作用是。

解析：（1）利用PCR技术扩增PEP基因时，需加入4种脱氧核苷酸作为原料。在PCR反应缓冲液中还要加入Mg2＋，其作用是激活耐高温的DNA聚合酶。

答案：（1）4种脱氧核苷酸激活耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）

（2）为方便将PEP反义基因与质粒连接，一般将限制酶的识别序列设计在引物上，在图乙中，与PEP基因上游结合的引物中应引入的识别序列。

解析：（2）为保证基因正常表达，应将基因插入到启动子和终止子之间，根据图中启动子和终止子的位置以及质粒上的限制酶种类分析，应选择BamHⅠ和SacⅠ两种限制酶，再结合图中质粒中箭头方向及PEP基因结构中箭头方向可知，若要构成反义PEP基因表达载体，PEP基因的上游引物应引入SacⅠ