病原菌的分离培养和纯化

一般植物病理学试验十七、病原菌的分别培育和纯化一、目的要求了解分别与纯化微生物的根本原理及方法。把握倒平板的方法和组织分别、稀释分别、平板划线分别的根本操作技术。(3)把握在平板、斜面及液体培育基上培育病原菌及观看其培育性状的方法。作中承受的稀释分别法或划线分别法。三、材料、仪器与用具材料(依当地状况进展选择，以下材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyriculariaorycae)。(2)玉米大斑病叶(exserohilumturcicum)。玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularialunata)。(4)玉米小斑病叶(bipolarismaydis)。番茄灰霉病果(botrytiscinefca)。黄瓜菌核病果(sclerotiniasclerotiorum)。黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonassyringaepv．1achrymans)。(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonascampestmspv.oryeue)。(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonassyringaepv．glycinea)。(10)白菜软腐病叶(erudniacarotovorasubsp．carotovora)。培育基pda培育基；肉膏蛋白胨培育基；加寄主组织煎汁的培育基等。镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0．11e2．5ml蒸馏水1000ml。四、试验操作(一)病原真菌的分别组织分别法依据以下步骤进展：取灭菌培育皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分别日期、材料和分别人工作台内，工作中临时去取简洁带来杂菌；保证工作人员自身的干净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。251--2滴(可削减细菌污染60c左右的pda10--15ml251～2在培育基中参加适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／ml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(5．0μg／ml)可以抑制g—细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／ml)可以抑制大局部细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前参加外，其45c左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)’时参加。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。取真菌叶斑病的颖病叶(或其他分别材料)斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3--4mm)病组织数块。提示：选择患病的组织作为分别生，因此，一般斑点病害应在接近健全组织的局部分别。703—5s0．1％升汞液中分别外表消毒0．5、1、2、3、5rain(也可使用其他外表消毒剂)，如植物组织柔嫩，则外表消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消退寄主外表的气泡，削减外表张力，70％的酒精亦用于外表消毒，处理的时间较短(lmin)。升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min3，5min。用无菌操作法将病组织移至平板培育基上，每皿内放4--6块。提示：在将病组织小块移污染。25123—4d后观对待分别菌生长结果。假设病组织小块上均长出较为全都的菌落，则多半为要分别的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)25察菌落生长状况，如无杂菌生长，即得该分别病菌纯菌种，便可置于冰箱中保存。提示：除依据菌落的全都性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。哪一种为其病原菌。在组织分别工作中，假设植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分别过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培育基上，完成分别工作。稀释分别法(1)取灭菌培育皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分别材料及分别人姓名。(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0．5～1．0ml。用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培育皿中的灭菌水混合，再从第一个培育皿移三环到其次个培育皿中，混合后再移三环到第三个培育皿中。45～50c的培育基，分别倒在三个培育皿中(为防止细菌污染，也可以向1-225％乳酸)，摇匀，凝固，要使培育基与稀释的菌液充分混匀。可将盛培育基的器皿靠在人手背上，假设手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50c。将培育皿翻转后置恒温箱(2513)(6)出较为整齐全都的单个菌落分别挑取，接种到斜面培育基上，置25℃左右培育。待菌长出后，检查菌是否单纯，假设有其他菌混杂，就要再一次进展分别纯化，直到获得纯株培育。(二)病原细菌的分别病原细菌的分别方法以稀释分别法和划线分别法为最常用。在进展分别释分别法以外，较为便利的是划线分别法：30c恒温箱中2—4h，使外表无水滴分散。也可凝成平板后直接使用。0．10．5--2min3次后，放在灭菌培育皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20—60min，让细菌释放到灭菌水中。用灭菌的接种铒(接种环)重要，这样做可以使第一批线和其次批线上的细菌数量相差很大。26～28c恒温箱中培育。1—3d后观看有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分别菌形成的。认真挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培育基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成征相全都时，即说明已获得纯培育。最好要经过连续三次单菌落的分别，才能确保纯化。(三)真菌、细菌培育性状观看(1)--(5)步骤进展，待某培育皿中形成单个菌落后观看。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培育基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培育基种类(成ph)和培育温度、光照条件。细菌培育性状观看仿照上述真菌菌落形成步骤，观看记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘外形、菌落外表是否有特别气味形成等。同时要记载培育基种类(ph)和培育温度、光照条件。用接种铒(环)2～3d颜色、边缘外形、外表是光亮还是粗糙有皱折、隆起状况、是否有色素分泌到培育基中，是(成分及ph)和培育温度、光照条件。用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培育基中，数日后观看也要记载培育基种类(成分及ph)和培育温度、光照条件。五、所需时间流程病原真菌分别组织分别：切取病组织，外表消毒，无菌水洗移人平板：1h。稀释分别：配孢子悬液，倒平板il7--10d30min7--10d检查斜面上分别菌产30min保存菌种病原细菌分别划线分别：倒平板沾菌悬液划线，1h。稀释分别1--3d观看迦些写报告病原细菌菌苔培育性状观看斜面上形成菌苔i-3d30min写报告30min2--3d30min写报告六、试验作业l.上交分别的病原真菌、细菌菌种。2．写出病原真菌、细菌培育性状观看的试验报告。七、思考题假设要分别的病原真菌是鞭毛菌中的腐霉菌、疫霉菌等应当如何进展才会获得更好的效果???观看记载真菌及细菌的培育性状有何意义?5．怎样才能知道你获得的病原真菌、细菌的菌种是否是纯培育?1常用的几种典型的病原菌分别方法斑点病原菌的分别。从病斑局部切取每边3—5mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移人0．13—5rain，以灭菌水冲洗3次，移置培育皿的培育基中，然后培育。维管束组织内病原菌的分别。从根茎维管束组织分别病菌，可先将寄主病部外表用70％升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培育基面上。根腐病病原菌的分别。根腐或基腐病的分别，由材料的大小打算。材料小的可仿照斑点病的分别法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分别法。肉质组织中病原菌的分别。多肉的根、茎及果实等，可以承受维管束组织内病菌分别法用此法再行分别。种子内病原菌