分子生物学常用技术(简化版)课件

第19章：分子生物学常用技术－－4学时分子杂交、PCR、基因测序蛋白质研究技术(双向电泳，酵母双杂交)基因转移与基因剔除(含RNA干扰)第20章：基因工程－－4学时第21章：基因诊断与基因治疗－－4学时第四篇：分子生物学技术与应用第19章：分子生物学常用技术－－4学时第四篇：分子生物学技术1第十九章分子生物学常用技术第十九章分子生物学常用技术2分子生物学技术能帮助我们干什么？揭示生物大分子(DNA、RNA、蛋白质)的结构与功能DNA

水平：基因序列分析、拷贝数和染色体定位RNA

水平：定量分析、基因表达产物的可变剪接分析蛋白质水平：蛋白质定量、定位、功能细胞与整体水平：基因在活体中的功能目的：了解疾病发生的规律，提供治疗与预防手段分子生物学技术能帮助我们干什么？揭示生物大分子(DNA、RN3我们需要了解和掌握哪些基本技术？基本技术：核酸：测序、印迹、杂交、体外扩增技术蛋白质：电泳与印迹、组学技术、相互作用综合技术：基因工程技术转基因生物与基因敲除技术应用技术：基因诊断基因治疗我们需要了解和掌握哪些基本技术？基本技术：4Molecularhybridization:利用已知核酸序列(探针/probe)检测与其互补的未知核酸序列用途：确认核酸序列间同源性对特定核酸序列进行定量自核酸混合体中辨认特定核酸序列第一节：核酸分子杂交Molecularhybridization:第一节：核酸5一、基本原理变性(denature)复性(renature)杂交(hybiridization)一、基本原理变性(denature)6核酸变性在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程破坏氢键与疏水作用可导致变性热变性：高温可使核酸变性，温度高于90℃时任何核酸双链都将变性酸碱变性：pH<3或pH>11时核酸将变性，DNA使用碱变性，RNA则不可化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素或甲酰胺可使核酸变性核酸变性在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程7变性温度Tm：meltingtemperature，解链温度或变性温度影响变性温度的因素：溶液的离子强度变性温度与离子强度正相关，低盐利于变性DNA分子的GC含量GC％＝(Tm－69.3)×2.24变性温度Tm：meltingtemperature，解链温8核酸复性变性的DNA单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋结构的过程复性类似与化学反应，需要一定反应时间核酸复性变性的DNA单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋9影响DNA复性速度的因素DNA分子的浓度：浓度高，复性快DNA分子的长度：长片段复性速度慢DNA分子的复杂性：重复序列复性速度快不同物种C0t曲线比较

人类基因组C0t曲线影响DNA复性速度的因素DNA分子的浓度：浓度高，复性10二、核酸探针Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列探针为DNA

或RNA，可以为单链或双链探针必需经过标记：放射性标记或非放射性标记二、核酸探针Probe：用于测定未知核酸片段的已知序列111.探针有哪些种类？DNA探针：常规探针利用基因组DNA序列或cDNA序列合成的探针，一般为双链，也可制备成单链RNA探针：高灵敏度探针

一般是通过体外转录而来，均为单链寡核苷酸探针(oligo-nucleotide)：用于点突变检测人工合成的短序列(~20nt)，可自由选择序列1.探针有哪些种类？DNA探针：常规探针122.标记物有哪些？标记物的要求：高度的灵敏性：足以检测到极微量的核酸序列高度的特异性：足以在大量非特异性序列中检测到特异的靶序列标记物的种类：放射性同位素(radioisotope)非放射性标记物(non-radioactivelabel)2.标记物有哪些？标记物的要求：13放射性同位素特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微量的核酸序列

g→mg→μg→ng→pg→fg常用的放射性同位素放射性同位素特点：灵敏度最高的标记物，足以检测到飞克级微量的14放射性标记的核苷酸单体dNTPorNTP5’or3’P32labelling放射性标记的核苷酸单体dNTPorNTP15非放射性标记物特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放射性同位素地高辛：通过地高辛抗体结合并检测生物素：结合亲和素/链亲和素(avidin/streptavidin)化学发光物质：通过紫外激发或化学反应而发光电子密度标记物：金等重金属非放射性标记物特点：安全且易于存放，但灵敏度与特异性均不及放163.如何检测杂交信号？同位素标记物：盖革计数器、液体闪烁计数器放射自显影(autoradiography)3.如何检测杂交信号？同位素标记物：17如何检测杂交信号？非放射性标记物：酶联免疫技术(enzymelinkedimmuno-assay)化学发光(chemiluminescence)如何检测杂交信号？非放射性标记物：18三、如何对核酸探针进行标记？三、如何对核酸探针进行标记？191.缺口平移nicktranslation:适用于标记双链DNA控制DNaseI的用量，可以控制探针的长度1.缺口平移nicktranslation:202.非放探针的酶促标记生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过酶促反应可以参入探针2.非放探针的酶促标记生物素或地高辛标记的核苷酸单体通过213.非放探针的化学标记利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结合3.非放探针的化学标记利用光敏基因经可见光照射直接与核酸结22四、如何进行杂交？样品(DNAorRNA)吸附于支持物尼龙膜、硝酸纤维膜、载玻片等与标记的探针杂交封闭液封闭后杂交，杂交炉中进行缓冲液清洗控制温度与变性剂浓度显色放射自显影/酶联显色四、如何进行杂交？样品(DNAorRNA)吸附于支持物23五、杂交有哪些不同的方式？斑点杂交：dothybridizationSouthern印迹杂交：SouthernblotNorthern印迹杂交：NorthernblotWesternblotting：不是杂交原位杂交：insituhybridization反Northern印迹杂交：reverseNorthernblot基因芯片/DNA微阵列：Genechip/DNAmicroarray五、杂交有哪些不同的方式？斑点杂交：dothybridiz24dothybridization将核酸样品直接点在杂交膜上与探针进行杂交特点：简便但特异性不高可探测核酸含量，但无法得知分子大小dothybridization将核酸样品直接点在杂交膜上25SouthernblotEdwinSouthern创立的方法电泳技术与杂交结合，可显示靶DNA序列的长度可进行毛吸管转移、真空转移与电转移SouthernblotEdwinSouthern创立26电泳转膜杂交电泳转膜杂交27Northernblot类似于Southern印迹杂交的方法，用于RNA检测Northernblot类似于Southern印迹杂交28insituhybridization原位杂交：特定mRNA的组织细胞分布insituhybridization原位杂交：特定m29FISHFluorescenceinsituhybridization

(FISH)：特定基因的染色体定位FISHFluorescenceinsituhybri30反Northern杂交与DNA芯片反Northern杂交：将探针DNA片段固定在杂交膜上，利用标记物标记的RNA进行杂交反Northern杂交与DNA芯片反Norther31第二节：聚合酶链式反应PCR，polymerasechainreaction在体外选择性扩增特定DNA片段的高效手段70年代有人提出PCR的设想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和适合的酶而无法进行1984年KaryMullis发明PCR，并因此获得1993年的诺贝尔化学奖全自动的热循环仪和多种PCR衍生技术使其成为重要的科学研究手段第二节：聚合酶链式反应PCR，polymerasechai32一、PCR的基本原理在体外，以特定引物引导，通过DNA

聚合酶选择性扩增特定区域变性(denature)退火(anneal)延伸(extension)一、PCR的基本原理在体外，以特定引物引导，通过DNA33DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGAC34ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNA解旋解链引物合成DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’335ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋解链引物合成新链延伸DNA的体内复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’336ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’变性复性加热退火DNA加热解链ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’337模板DNA94℃模板DNA94℃3855℃引物1引物2DNA引物55℃引物1引物2DNA引物39引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶40第1轮结束94℃第2轮开始第1轮结束94℃第2轮开始4172℃TaqTaqTaqTaq55℃72℃TaqTaqTaqTaq55℃42第2轮结束第2轮结束43重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

重复30轮后模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩441234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性新链延伸DNA的体外扩增热循环DNA解链1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸345PCR反应体系4种dNTP混合物各200µmol/L引物各0.1-0.5µmol/L模板DNA

0.1～2µgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/LDNA的体外扩增PCR反应体系DNA的体外扩增46PCR技术的特点高度的灵敏性：理论上经20循环可将目的基因片段扩增220＝1000000倍高度的特异性：利用引物与模板的特异性配对，可保证扩增的特异性一对20碱基长引物的多样性为440＝1024应用的广泛性：目前已经成为分子生物学研究必不可少的手段操作的简便性：不需要复杂的设备和繁琐的流程PCR技术的特点高度的灵敏性：理论上经20循环可将目的47二、做PCR要有什么条件？酶：TaqDNA聚合酶模板DNA：可以为基因组DNA或cDNA引物：人工合成的寡核苷酸片段dNTP：聚合反应的核苷酸单体缓冲液：包含特定的pH、离子强度和Mg2+反应程序：变性、退火、延伸组成的循环仪器：DNA热循环仪，或称PCR仪二、做PCR要有什么条件？酶：TaqDNA聚合酶48DNA聚合酶催化的聚合反应dNTPDNA聚合酶催化的聚合反应dNTP491.什么是耐热DNA聚合酶早期PCR曾使用DNA聚合酶I在高温时发生变性，每一循环都需要重新添加酶延伸反应温度为37℃，非特异性太多目前常用

TaqDNA

聚合酶纯化自嗜热水生菌

(Thermusaquaticus)可耐受95℃高温，最适反应温度为72℃左右1.什么是耐热DNA聚合酶早期PCR曾使用DNA50TaqDNApolymerase在70~75℃范围活性最佳，每秒可延伸150nt95℃时的半衰期为40min按变性时间1min计，能满足30循环的反应Taq酶具有5’→3’聚合活性和5’→3’外切活性不具备校读活性，错误率为2×10－4左右错误合成的DNA片段可以作为模板，循环数越多，最终扩增产物错误率越高只能用于检测，不适合基因克隆TaqDNApolymerase在70~75℃范围活51有保真性的耐热DNA聚合酶吗？PfuDNApolymerase：常用的高保真耐热DNA聚合酶有5’→3’

外切活性错误率约1×10－6适应于基因克隆有保真性的耐热DNA聚合酶吗？PfuDNApolym522.如何设计寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR反应必备的前提，对PCR产物类型、长度和反应的特异性具有决定作用PCR需要两条引物，引物决定扩增范围和扩增片段长度2.如何设计寡聚核苷酸引物？引物(primer)是PCR53引物设计原则引物长度一般为15~30核苷酸引物太短影响杂交体的稳定和特异性引物太长随机匹配序列增多，特异性反而下降GC含量一般为40％~60％应充分考虑退火温度(annealingtemperature)GC含量低，退火温度低，易出现非特异GC含量高，非特异性结合也会增加引物解链温度粗略计算公式：

引物的解链温度Tm＝4(G＋C)＋2(A＋T)引物设计原则引物长度一般为15~30核苷酸54引物设计原则引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发卡结构

两条引物间、同一引物的分子间不应存在互补序列出现互补易导致引物二聚体的出现，影响扩增效率引物设计原则引物自身不应该存在链内互补序列，以防止出现发卡结55引物设计原则避免引物与非特异序列间的同源性引物的3，末端必须与模板完全互补，5，末端允许添加非配对序列5，末端允许添加非匹配序列，如：酶切位点5’3’引物设计原则避免引物与非特异序列间的同源性5’3’563.如何选择dNTP和缓冲液?dNTP是聚合反应的底物常规使用浓度：0.2mMeach探针标记时，可使用同位素或非放标记的dNTP缓冲液：特定的pH和离子强度Mg2＋浓度一般为1.5mMPCRmix：预制的便捷反应体系3.如何选择dNTP和缓冲液?dNTP是聚合反应的底574.用什么做模板DNA？PCR的模板(template)可以是基因组DNA

或cDNA逆转录-PCR(reversetranscriptionPCR)：RT-PCR在利用DNA为模板进行扩增时纯化比较简单血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本经简单处理后均可直接进行PCR扩增RNA样品一般要经过严格纯化，并逆转录未经纯化的RNA不稳定，无法进行逆转录反应体系中如存在DNA，将对RNA扩增产生干扰4.用什么做模板DNA？PCR的模板(template586.如何设计反应程序？PCR的循环数：理论上20~25即可满足扩增需要，但实际循环数一般为25~35过多循环后到达平台期，继续延长循环数无效模板浓度高时平台期出现早，模板浓度低时平台期出现晚，应根据模板浓度调节循环数6.如何设计反应程序？PCR的循环数：模板浓度高时平台期59反应程序的关键是退火温度退火温度：提高退火温度有助于提高反应的特异性退火温度过高将导致引物与模板无法配对，影响扩增效率反应的退火温度主要取决于引物序列反应程序的关键是退火温度退火温度：60三、我们能用PCR做什么？自PCR技术创立以来，经近20年的发展，在基本PCR技术基础上产生了多种PCR的衍生技术，应用于各种不同的目的基因克隆或亚克隆－－基因工程特定基因表达量的分析基因突变的检测－－基因诊断病原体特征性序列的鉴定－－基因诊断定点诱变－－第4节DNA序列测定－－第3节三、我们能用PCR做什么？自PCR技术创立以来，经近61最常用的

PCR是RT-PCRRT-PCR：reversetranscriptionPCR以mRNA为模板先进行逆转录，再进行PCR为什么要以mRNA为模板？mRNA无内含子，克隆的基因可在原核表达mRNA的量代表了基因的表达水平最常用的PCR是RT-PCRRT-PCR：revers62如何利用

RT-PCR检测基因表达水平?定量PCR(quantitative

PCR)PCR产物的量与起始的模板量有关利用PCR对模板DNA或cDNA进行定量测定定量PCR一般用于特定基因mRNA水平的检测RT-PCR可用于基因表达水平检测需设定内部参照物(referencegene)，如：GAPDH、actin、18srRNA等稳定表达基因定量是相对的，一般是不准确的如何利用RT-PCR检测基因表达水平?定量PCR(q63为什么说RT-PCR定量是不准确的？

指数扩增期，产物量与模板量成正比进入平台期，产物量不能再反应模板量不同样品进入平台期的循环数不同，难以选择测定的时间节点为什么说RT-PCR定量是不准确的？指数扩增期，产物量64有精确定量方法吗？实时荧光定量PCR(real-timePCR)：以产物量到达一定阈值所需要的循环数为定量标准需要对PCR产物的生成量进行动态监控有精确定量方法吗？实时荧光定量PCR(real-time65如何进行产物量的实时检测？需要荧光标记探针与两侧PCR引物探针标记有报告荧光与粹灭荧光反应过程中探针被降解，报告荧光显色可通过荧光定量PCR仪进行实时监控如何进行产物量的实时检测？需要荧光标记探针与两侧PCR引66巢式PCR可以提高扩增效率和特异性

Nested-primerPCR内外两套引物分两轮进行扩增在克隆一些低丰度基因时可以采用经过两轮PCR扩增，具有更高的灵敏度四条引物均与模板匹配，因此增加了特异性巢式PCR可以提高扩增效率和特异性Nested-pri67可以利用多对引物进行多重PCR多重PCR(multi-primerPCR)多组引物同时进行的PCR，可大幅度降低PCR反应的工作量可以利用多对引物进行多重PCR多重PCR(multi-p68可以在组织切片上进行原位PCR原位PCR(insituPCR)在组织切片或细胞涂片上进行的PCR方法主要用于特定基因表达水平的原位分析组织切片经过固定、蛋白酶和DNase消化后进行RT-PCR扩增可以在组织切片上进行原位PCR原位PCR(insitu69Sequencing：基因结构分析的最基本方法主要方式：化学降解法酶法：Sanger法/双脱氧链末端终止法二代/三代测序技术第三节：基因测序Sequencing：基因结构分析的最基本方法第三节：基因测70适用于寡核苷酸片段测序的方法基本反应：G：DMSG/A：哌啶T/C：肼(低盐)C：肼(高盐)一、化学降解法适用于寡核苷酸片段测序的方法一、化学降解法71Sanger在1977年建立的方法，也称酶法测序DNA序列测定的最常用方法二、双脱氧末端终止法在反应体系中加入2’,3’-ddNTP，由于其没有3’-OH而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止。Sanger在1977年建立的方法，也称酶法测序二、双72Sanger法测序Sanger法测序73模板：单链→单双链均可酶：Klenow→耐热DNA聚合酶标记：同位素标记→荧光标记电泳：平板电泳→毛细管电泳

4泳道→单一泳道酶法测序的自动化程度越来越高模板：单链→单双链均可酶法测序的自动化程度越来越高74二代测序技术(next-generationsequencing)1天完成全基因组测序罗氏、Solexa、ABI等公司各有不同技术利用微珠或芯片实现大通量，边合成边测序三代测序技术(next-next-generationsequencing)：3分钟完成全基因组测序基于纳米微孔的单分子测序技术二代测序与三代测序技术二代测序技术(next-generationsequenc75第四节：DNA定点诱变技术(自学）目前主要用PCR方法进行定点诱变也可进行突变基于的全合成第四节：DNA定点诱变技术(自学）目前主要用PCR方法76第五节：RNA干扰技术学习基因工程之后，在基因剔除技术部分介绍第五节：RNA干扰技术学习基因工程之后，在基因剔除技术部分77第六节：生物芯片生物芯片(biochip)：基于微电子技术和生物信息技术建立的高度集成化的生物样本分析方法生物芯片是后基因组时代的利器生物芯片有哪些种类？DNAmicroarrayProteinmicroarrayAntibodymicroarrayChemicalcompoundmicroarrayTissuemicroarray第六节：生物芯片生物芯片(biochip)：基于微电子技术和78什么是基因芯片技术？基因芯片(genechip)，一种高通量的核酸杂交方法，又称DNA微阵列(DNAmicroarray)将大量探针固定与固相支持物，与标记的待测样品进行杂交的方法Affymetrix公司已经将GeneChip注册什么是基因芯片技术？基因芯片(genechip)，一种高通79如何制作基因芯片？cDNA芯片：cDNA片段以显微打印的方式固定于固相支持物表面，集成度较低原位合成芯片：以激光蚀刻技术直接合成寡核苷酸探针，集成度可达105点阵/cm2以上如何制作基因芯片？cDNA芯片：cDNA片段以显微打印的80基因芯片能帮助我们干什么？基因表达谱芯片(geneexpressionprofile)：基因表达的大通量分析SNP芯片(singlenucleotidepolymorphism)：单核苷酸多态性的大通量检测微小RNA芯片(miRNA)：分析microRNA甲基化芯片：分析基因组甲基化状态ChIP-chip(chromatinimmunoprecipitation)：分析DNA与蛋白质的相互作用基因芯片能帮助我们干什么？基因表达谱芯片(geneexpr81芯片的主要工作流程选择与购买芯片准备样品标记样品杂交检测杂交信号分析处理结果芯片的主要工作流程选择与购买芯片82第七/八节：蛋白质分析方法蛋白质的定量分析：ELISA(Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay)Westernblot蛋白质的定位：免疫组织化学荧光蛋白的活细胞定位蛋白质相互作用的研究蛋白质功能的研究蛋白质组学技术第七/八节：蛋白质分析方法蛋白质的定量分析：83Proteomics蛋白质组与蛋白质组学：对特定组织细胞总蛋白的整体性研究Proteomics蛋白质组与蛋白质组学：84蛋白质组学研究的目的什么？解读基因组：基因组编码了多少基因？蛋白表达：比研究RNA表达深入了一步蛋白功能：超过1/3的蛋白质功能不明确蛋白质修饰：糖基化、磷酸化、酶解等蛋白质定位：subproteome蛋白-蛋白相互作用：互作是功能的基础蛋白质组学研究的目的什么？解读基因组：基因组编码了多少基因？85蛋白质组学的核心技术是什么？1975年，双向电泳技术建立1990年，更