目的基因的制备课件

第五章目的基因的制备第一节目的基因的制备第二节目的基因的分离8/14/20231第五章目的基因的制备第一节目的基因的制备8/1/202一概述基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。目的基因确定其表达调控机制和生物学功能建立高效表达系统构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）体外进行必要的结构功能修饰输回细胞内改良生物体遗传性状，包括人体基因治疗8/14/20232一概述基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从二什么是目的基因基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的基因。如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因、工业用酶等相关基因等。8/14/20233二什么是目的基因基因工程的主要目的是使优良性状相关的基一般来说，目的基因的制备战略分为两大类一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。8/14/20234一般来说，目的基因的制备战略分为两大类8/1/20234第一节目的基因的制备1、直接法制备基因2、从基因组文库中钓取目的基因3、从cDNA文库中钓取目的基因4、通过PCR直接扩增出目的基因8/14/20235第一节目的基因的制备第一节目的基因的制备1、直接法制备基因8/1/202351.1限制性核酸内切酶酶切分离法限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组（如质粒和病毒）中分离目的基因。①对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。②对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点，用适当的限制性内切酶切割，一次就可获得目的基因。8/14/202361.1限制性核酸内切酶酶切分离法限制性内切酶酶切分离法适于

所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。1977年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因

基因人胰岛素转运RNA-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素-干扰素大小（bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶Ａ大小（bp）105777170385324375合成年代1985198519851985198619871.2化学法直接合成基因8/14/20237所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序1.2.1.1小片段粘接法：

混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

1.2.1化学合成法的基本战略全基因合成有三种战略：8/14/202381.2.1.1小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

Klenow酶聚合1.2.1.2补钉延长法根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段8/14/20239混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Kleno根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

Klenow酶聚合1.2.1.3大片段酶促法

8/14/202310根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片1.2.1.4三种方法各有利弊化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%8/14/2023111.2.1.4三种方法各有利弊化学合成DNA的单1.2.2化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的8/14/2023121.2.2化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活缩合氧化脱取代基玻璃珠化学合成的单元操作DMT：二甲氧基三苯甲基连接臂8/14/202313OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMe合成天然基因修饰改造基因

设计新型基因

制备探针、引物、接头

1.2.3DNA化学合成的用途如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等

8/14/202314合成天然基因修饰改造基因设计新型基因制备探针、引物、接头第一节目的基因的制备1直接法制备基因2从基因组文库中钓取目的基因3从cDNA文库中钓取目的基因4利用PCR直接扩增出目的基因8/14/202315第一节目的基因的制备第一节目的基因的制备1直接法制备基因8/1/20231对于高等真核生物而言，基因组DNA庞大，组成结构复杂，存在间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增,而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来。8/14/202316对于高等真核生物而言，基因组DNA庞大，组成结构复杂，存在间2、从基因组文库中钓取目的基因2.1基因文库的构建2.1.1基因文库的基本概念基因库(genepool):特定生物体全基因组的集合（天然存在）

基因文库(genelibraryorgenebank):从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）一个受体菌的群体之中,这个群体即为这种生物的基因文库。根据构建方法的不同，基因文库分为:基因组文库（含有全部基因）；cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）8/14/202317第一节目的基因的制备2、从基因组文库中钓取目的基因2.1基因文库的构建8/1/22.1.2基因文库构建的材料来源材料来自染色体DNA或mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库8/14/202318第一节目的基因的制备2.1.2基因文库构建的材料来源材料来自染色体DNA或m2.1.3基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小

N=ln(1–P)/ln(1–f)例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆8/14/2023192.1.3基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基Forexample:

期望值为0.99，插入片断为20kb的

E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算N

E.coli==1.1×103ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]

这个例子说明用质粒载体（插入片段5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。8/14/202320Forexample:ln(1-0.99)ln[2.1.4基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选8/14/202321第一节目的基因的制备2.1.4基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想2.1.5基因文库的构建技术路线①材料的选择及基因组DNA的制备；②载体的选择；③载体与基因组DNA的限制性酶切；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的筛选和保存。8/14/2023222.1.5基因文库的构建技术路线①材料的选择及基因组DNA的2.1.5.1基因组DNA的制备AAAA文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段8/14/202323第一节目的基因的制备2.1.5.1基因组DNA的制备AAAA文库构建的DNA在2.1.5.2载体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种载体的最大装载量如下：l-DNA质粒考斯质粒10kb23kb45kbBAC300kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌8/14/202324第一节目的基因的制备2.1.5.2载体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组2.1.5.3载体与基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一保证DNA片段之间存在部分重叠区。第二保证DNA片段大小均一。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，这样DNA酶解片段的大小可控。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。8/14/202325第一节目的基因的制备2.1.5.3载体与基因组DNA的切割用于基因组文库构建的2.1.5.4载体与外源片段的连接

（1）连接酶DNA连接酶；T4DNA连接酶；E.coliDNA连接酶它们都可以催化5’末端磷酸和3’末端羟基形成磷酸二酯键。但由于T4DNA连接酶既能连接粘性末端还能连接平末端，而E.coliDNA连接酶主要连接粘性末端，所以一般连接反应中都用T4DNA连接酶。8/14/202326第一节目的基因的制备2.1.5.4载体与外源片段的连接

（1）连接酶DN（2）连接反应的效率连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末端的特性、DNA末端的浓度以及所用的连接酶量有关。平末端连接反应的效率相对较低，它需要较高浓度的平末端、较大的连接酶量、较低浓度的ATP以及不能有象亚精胺一类的多胺。在连接反应中加入15％的PEG8000或1～1.5pmol／L氯化六氨合钴等浓缩剂可极大地促进平末端反应的连接速度，同时可改变不同连接产物的比例，使连接产物增多。8/14/202327第一节目的基因的制备（2）连接反应的效率连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末（3）避免外源DNA片段之间的连接措施在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！！！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：

将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团

用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端8/14/202328第一节目的基因的制备（3）避免外源DNA片段之间的连接措施在基因组文库的构建过程8/14/202329第一节目的基因的制备8/1/202329第一节目的基因的制备2.1.5.5重组DNA导入宿主及筛选转化转导转染感染结合其它8/14/202330第一节目的基因的制备2.1.5.5重组DNA导入宿主及筛选转化8/1/202密集铺板（1-10万）杂交挖取目的重组克隆铺板铺板8/14/202331密集铺板（1-10万）杂交挖取目的重组克隆铺板铺板8/1/2构建噬菌体基因组文库的主要步骤

8/14/202332第一节目的基因的制备构建噬菌体基因组文库的主要步骤8/1/202332第一节用粘粒载体建立基因组文库的主要步骤8/14/202333第一节目的基因的制备用粘粒载体建立基因组文库的主要步骤8/1/202333第一节2.1.5.6基因组文库重组克隆的排序大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然而基因文库的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息顺序。这项工作的工作量可能远大于基因组文库的构建，属于基因文库的后期制作8/14/202334第一节目的基因的制备2.1.5.6基因组文库重组克隆的排序大型基因文库（包括（1）酶切片段末端标记法将单一的YAC克隆插入DNA片段用限制性内切酶分布均匀地水解成若干片段，末端标记同位素。然后再用Sau3AI或MboI将末端标记的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝胶电泳，每10个YAC克隆走在同一块板上，形成10个克隆的特征性DNA指纹图谱电脑分析指纹图谱，如发现任何两个克隆DNA的指纹图谱有部分相同的，则其两个YAC片段就有互相重叠的可能性，于是这两个YAC克隆的DNA片段克隆在染色体上是排列一起的8/14/202335第一节目的基因的制备（1）酶切片段末端标记法将单一的YAC克隆插入DNA片段用限HHHHSSSSSSSSSSSSSSSSSSS单一克隆指纹图谱十克隆指纹图谱载体DNA克隆DNA8/14/202336第一节目的基因的制备HHHHSSSSSSSSSSSSSSSSSSS单一克隆指纹图（2）随机探针联合杂交法将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制二十份薄膜；合成20种不同序列的短探针，其序列是随机的。用20种探针随机定位杂交（一对一）20份YAC克隆薄膜。如果某两个克隆同时对同一种探针呈现杂交阳性反应，则这两个克隆有可能是相互重叠的。若将杂交阳性结果记为“1”，而阴性结果记为“0”，可清晰地列成一张表，最终排出上述YAC克隆的排列顺序。8/14/202337第一节目的基因的制备（2）随机探针联合杂交法将若干YAC克隆固定在薄膜上，并复制0102030405060708091011121314151617181920A

B

CDE

FG0102030405060708091011121314151617181920DABCEFG1111111111111111111111111111118/14/2023380102030405060708091011121314150104120613140217071911150508160310092018DABCEFG111111111111111111111111111111FCADGEB8/14/202339010412061314021707191115050816（3）染色体走读法（chromosomewalking）从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5~2.0kb范围内分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点8/14/202340（3）染色体走读法（chromosomewalking）从染色体走读法（chromosomewalking）走读的起点克隆片段亚克隆旁测序列探针标记第一轮杂交阳性克隆阳性克隆第二轮杂交第二轮杂交8/14/202341染色体走读法（chromosomewalking）走读的起染色体走读法（chromosomewalking）走读的起点克隆片段8/14/202342染色体走读法（chromosomewalking）走读的起2.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因构建了基因文库仅仅是完成了基因克隆，并不等于完成了基因分离。构建成的文库仅是一个杂乱无章的“基因图书馆”，要想从中找到所需基因，必须有一些相关线索。分离目的基因也要知道与目的基因有关的某些或某个特征，才能据此找到相关基因。主要方法有：核酸杂交方法；免疫学检测方法；DNA同胞选择法（极少用）；PCR筛选法；其他方法。8/14/2023432.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因构建了基因文库仅（1）核酸杂交方法适用于大量筛选，常用，可靠。但需制备探针，所用探针有多种，获得探针的方法很多；（2）免疫学检测方法（3）DNA同胞选择法（极少用）使用抗体探针，通过检测重组克隆表达出的蛋白质来筛选目的克隆。只适用于表达文库的筛选，并只能筛选出表达了的克隆。DNA同胞选择法是按矩阵分值亚库，用mRNA与cDNA杂交后释放出mRNA，使其在无细胞蛋白合成体系中翻译，并对翻译产物进行免疫沉淀、PAGE电影鉴定或活性分析等来筛选目的快乐，该方法要求全长cDNA，一般只在无其他方法可用或表达产物很小时才用8/14/202344（1）核酸杂交方法适用于大量筛选，常用，可靠。但需制备探针，（4）PCR筛选法其显著特点是快速、简便。该方法的基本策略是采用“反应池”，将基因文库分装96孔培养板，如有2304个克隆分别置于24个96孔培养板中，现以反应板为单位，将96个克隆混合成一个“反应池”，进行一个PCR反应，如图：8/14/202345（4）PCR筛选法其显著特点是快速、简便。该方法的基本策略是从24个反应板中找出具有阳性克隆的反应板，再将该板中的12个横向克隆与8个纵向克隆分别混合，形成12个横向池及8个纵向池，进行20个（8+12）反应，如图，横向阳性池与纵向阳性池交叉的孔为阳性单克隆，通过44个反应可从2304个克隆中筛选分离出单个克隆。8/14/202346从24个反应板中找出具有阳性克隆的反应板，再将该板中的12个大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化机械切割双链cDNA的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定核酸杂交免疫学分析酶切鉴定8/14/202347大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案DNA片段载体构建细2.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因总结图图克隆策略的一般总结，箭头显示了最佳路线。注意，在以细胞为基础的克隆策略中，DNA最初是由非特异性的方法并克隆的，因此在结尾步骤需要筛选出目标克隆。相反地，当特异性的DNA片段是通过PCR或直接化学合成的方式获得的时候，也就不需要后续的筛选了。

8/14/202348第一节目的基因的制备2.1.5.7从基因组文库中钓取目的基因总结图图克隆策略的一第一节目的基因的制备1、直接法制备基因2、从基因组文库中钓取目的基因3、从cDNA文库中钓取目的基因4、通过PCR直接扩增出目的基因8/14/202349第一节目的基因的制备第一节目的基因的制备1、直接法制备基因8/1/202343从cDNA文库中钓取目的基因3.1cDNA文库的构建3.2

cDNA克隆的操作流程8/14/202350第一节目的基因的制备3从cDNA文库中钓取目的基因3.1cDNA文库的构建3.1.1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。3.1.2.cDNAlibrarymRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。3.1cDNA文库的构建8/14/2023513.1.1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cD（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。

（3）包含了所有编码蛋白质的基因。

（4）比DNA文库小的多，容易构建。3.1.4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.1.3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。8/14/202352（1）不含内含子序列。3.1.4.构建cDNA文库的一般分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。

利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）8/14/202353分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利8/14/2023548/1/202354反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。

mRNAcDNA3’

5’

5’

AAAAAAATTTTTTTOligodT引物8/14/202355反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’

3’

5’

5’

反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’

3’

5’

5’

引物cDNA第一链3’

5’

引物②

降解mRNA模板或RNaseH碱8/14/202356用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mR剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’

cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

③cDNA第二链合成8/14/202357剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

cDNA第一链cDNA第二链5’

3’

5’

3’

8/14/202358④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。3.1.5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶8/14/202359在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。8/14/2023608/1/2023603.2cDNA克隆的操作流程随着cDNA从克隆经验的积累和方法的不断改进，逐渐形成了下列相对成熟和标准的构建cDNA文库的操作流程。①转录酶以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。②用RNaseH和大肠杆菌聚合酶Ⅰ等合成cDNA第二链。③cDNA的甲基化(非必需步骤)。④cDNA与接头连接，并经限制酶消化产生黏性末端。⑤cDNA的分部收集(非必需步骤)。⑥cDNA与末端匹配的载体连接。⑦重组cDNA导人宿主菌。8/14/2023613.2cDNA克隆的操作流程随着cDNA从克隆经验的积累第一节目的基因的制备1、直接法制备基因2、从基因组文库中钓取目的基因3、从cDNA文库中钓取目的基因4、通过PCR直接扩增出目的基因8/14/202362第一节目的基因的制备第一节目的基因的制备1、直接法制备基因8/1/202364通过PCR直接扩增出目的基因前提:目的基因的全序列或其两侧序列为已知，合成一对与模板DNA互补的引物，扩增出DNA片段。模板：基因组DNA，mRNA序列，或是已克隆到某一载体上的基因片段。为了克隆操作的方便或保证克隆后续工作需要，常常要在设计引物时对其两端作一些修饰，如带限制性内切酶切点,某种启动子序列或起始或终止密码等,便于下一步的重组克隆和基因的表达和调控研究。8/14/202363第一节目的基因的制备4通过PCR直接扩增出目的基因前提:目的基因的全序列或其两通过PCR直接扩增出目的基因策略8/14/202364通过PCR直接扩增出目的基因策略8/1/202364优缺点：与传统的DNA克隆方法比较，省时、省力,但要求待扩增的DNA片段的序列必需是已知的，至少要求两端长约20bp的序列是已知的。另外，合成的DNA片段长度有限，一般在2kb以内，超过2kb时扩增效果显著下降。如要大量扩增未知序列的特异DNA片段，或是更长的DNA片段，则须选择特殊类型的PCR策略。通常PCR反应有如下几种类型:8/14/202365第一节目的基因的制备优缺点：与传统的DNA克隆方法比较，省时、省力,但要求待扩4.1套式PCR（nestedPCR）也叫巢式PCR，是指用两对引物扩增同一样品的方法。即在两对引物中，一对引物与靶序列的复性结合位点处于另一对引物扩增的DNA序列内，前者称为内部引物，后者称为外侧引物。一般先用外侧引物扩增一段较长的靶序列，然后以第一次扩增的产物为模板，再用内部引物扩增其中的部分片段。套式PCR较常规PCR灵敏度大大提高，同时也有较强的的特异性，假阳性极少。8/14/2023664.1套式PCR（nestedPCR）也叫巢式PCR4.2反向

PCR(inversePCR)当一个未知序列位于已知序列的上游，一般可用已知靶序列的一个引物(即与3‘端互补的引物)进行单向PCR线性扩增,而反向PCR技术则可利用二个靶序列引物对未知片段进行常规PCR扩增。反向PCR包括下列三个步骤8/14/202367第一节目的基因的制备4.2反向PCR(inversePCR)当一个未知序列首先，用限制性核酸内切酶消化待测线性DNA模板。其次，使酶切后的线性DNA模板连接成为环状分子，或加上衔接头后再连接成环状。第三，用另一种限制酶消化，将环状DNA从已知区域中间切开，则线性化DNA的两侧为已知序列，未知区域夹在中间，用与已知区域可使未知序列大量扩增出来。8/14/202368第一节目的基因的制备首先，用限制性核酸内切酶消化待测线性DNA模板。8/1/204.3锚定PCR(anchoredPCR)锚定PCR，又称为单侧PCR，是指通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列的方法。常见的锚定PCR类型是利用未知序列中一小段已知序列的信息来扩增合成已知序列上游或下游片段，最后获得全部序列。8/14/202369第一节目的基因的制备4.3锚定PCR(anchoredPCR)锚定PCR，其基本步骤与此po1y(dG)相对应的poly(dC)即为锚定引物。为保证扩增特异性，锚定引物通常在12碱基以上。在锚定引物和与基因特异配对的引物参与下，可以扩增带有同源多聚物尾巴的cDNA序列。与基因特异配对的引物通常是在未知序列中一小段已知序列的基础上设计合成的，而该已知序列一般是由纯化蛋白的部分氨基酸序列推测出来或从其他材料中获得的部分mRNA序列。分离细胞总RNA或mRNA合成cDNA逆转录酶在cDNA3‘末端加上poly(dG)尾DNA末端转移酶8/14/202370第一节目的基因的制备其基本步骤与此po1y(dG)相对应的poly(dC)即为锚4.4反转录PCR（RT-PCR）RT-PCR，是将mRNA反转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。通过mRNA反转录，得到对应的cDNA，然后利用特定的PCR引物直接以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得大量所需的基因。反转录可用总RNA或总poly(A)RNA为模板进行，反转录产物也无须转变成双链cDNA,即可进行PCR扩增。8/14/202371第一节目的基因的制备4.4反转录PCR（RT-PCR）RT-PCR，是将mR第一连续RT-PCR(两阶段单管式)由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，连续RT-PCR将这两种不同的酶催化过程放在一个管中连续反应，但在空间上两种反应仍是分开进行。在该程序中利用一种特制蜡烛冷却形成的蜡层，将两种反应混合物分开成上下两层，反应首先在较低的温度下进行反转录，由mRNA合成cDNA；当反应结束,温度升高到95℃，使蜡层熔化，上下层反应液混合在一起，下层混合物中的TaqDNA聚合酶利用上层合成的cDNA作为模板进行PCR扩增。8/14/202372第一节目的基因的制备第一连续RT-PCR(两阶段单管式)由mRNA反转录第二长距离RT-PCR(两阶段双管式)长距离RT-PCR与连续RT-PCR都是使两种酶促反应分开进行，但长距离RT-PCR能扩增全长cDNA，得到更长的DNA产物。在反转录阶段，首先使模板——引物融合，然后再加入反应混合物并预热，最后加逆转录酶，这样便分别满足各个步骤的最适条件。进行PCR循环时，首先进行95℃热起始，再加入TaqDNA聚合酶，采用双shuttlePCR程序延长合成时间，由此扩增出长达4～6kb的DNA片段。8/14/202373第一节目的基因的制备第二长距离RT-PCR(两阶段双管式)长距离RT-4.5锅柄PCR（panhandlePCR）用PCR扩增未知序列，因为不能设计所需要的引物而难以实现。锅柄PCR就是为扩增未知序列而设计的一种策略。如果一段未知序列处于已知序列的上游，那么可根据已知的3‘端序列设计引物而扩增出未知序列，如果未知序列位于已知序列下游则须将5’端的已知序列拷贝到未知序列的下游，这样使未知序列的两侧都含有已知序列，据此可以扩增未知片段，也能从3‘，5’两端测定已知基因的序列。8/14/202374第一节目的基因的制备4.5锅柄PCR（panhandlePCR）用PCR锅柄PCR实施步骤①用内切酶消化环状dsDNA产生5‘黏末端线型DNA片段，用Klenow酶填平5’黏末端，然后用BAP脱去5'磷酸，避免自我环化。②合成一个与5‘末端碱基和已知基因的5’端内部某个区域能互补的附加引物，与上述线性化片段的3’端连接，5'端由于脱磷而不能连接。8/14/202375第一节目的基因的制备锅柄PCR实施步骤①用内切酶消化环状dsDNA产生5‘黏末③将连接物变性后再冷却复性，其中一条单链DNA分子(负链)由于附加引物而与互补区域以碱基配对形成锅柄状的链内二级结构，而正链的附加引物是不能互补的。④锅柄结构中出现一个龟缩的3‘端，它可作为引物进行PCR扩增，经变性成单链后而使未知区域的3’，5'两侧都带有完整的已知基因序列。8/14/202376第一节目的基因的制备③将连接物变性后再冷却复性，其中一条单链DNA分子(负链)由⑤以3‘端的引物进行单向PCR扩增，合成另一条链，不过如果全部序列太长，则难以达到5’端的已知区域，得不到全长片段。⑥变性后再次冷却生成链内二级结构，得到另一条链的模板，龟缩的3‘端同样可作引物进行PCR扩增而得到全长片段，其中未知基因处于中间，3‘、5'两侧是已知基因的全序列。⑦套式PCR:用引物对(l)和(2)或(3)分别作外侧引物和内部引物可以扩增不同长度的DNA片段，其中包括完整的已知序列。8/14/202377⑤以3‘端的引物进行单向PCR扩增，合成另一条链，不过如果第五章目的基因的制备第一节目的基因的制备第二节目的基因的分离

8/14/202378第五章目的基因的制备第一节目的基因的制备8/1/202第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆2序列克隆法3差别杂交及减法杂交技术4差示分析法5功能结合法6其他方法8/14/202379第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆8/1/20第二节目的基因的分离在基因文库中,不论是cDNA文库还是基因组DNA文库,含目的基因的克隆子都只是数以万计的克隆子中的一个,究竟哪一个克隆子含有我们所要研究的目的基因？因此克隆一个基因的下一个步骤就是从基因文库中筛选分离出含有目的基因的特定克隆子。这个步骤可以依据待分离目的基因的有关特性,如基因的序列、功能、在染色体上的位置和转录产物mRNA等,建立相应的方法加以完成。8/14/202380第二节目的基因的分离第二节目的基因的分离在基因文库中,不论是cDNA文库还是第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆筛选2序列克隆法筛选3差别杂交及减法杂交技术筛选4差示分析法筛选5功能结合法筛选6其他筛选方法8/14/202381第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆筛选8/1/1目的基因的功能克隆筛选法1.1根据特异蛋白分离目的基因在基因工程发展的早期阶段，有关功能基因的分离与克隆多是在特异蛋白分离、纯化和测序的基础上完成的。这也是通常所说的目的基因的功能克隆策略。一定发育时期的特异蛋白的分离测定特异氨基酸序列推测编码该蛋白的核苷酸序列合成一段寡核苷酸探针从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因

作为抗原,利用免疫动物制备抗体cDNA表达文库,分离出含目的基因的克隆

基本过程是：8/14/202382第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆筛选法1.1根据特异蛋白分离目的基1.2功能互补法克隆基因功能互补克隆技术，是利用被克隆的DNA片段与寄主细胞的染色体DNA在功能上有同源互补性来进行目的基因直接分离的。一种最简单的方式是，将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”中的重组DNA分子分别导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞，然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需要的营养底物的基本培养基上结果只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才会长成转化子菌落。8/14/202383第二节目的基因的分离1.2功能互补法克隆基因功能互补克隆技术，是利用被克隆的第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆筛选2序列克隆法筛选3差别杂交及减法杂交技术筛选4差示分析法筛选5功能结合法筛选6其他筛选方法8/14/202384第二节目的基因的分离1目的基因的功能克隆筛选8/1/2序列克隆法筛选2.1根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因最直接方法是用核酸探针进行杂交筛选。可先从DNA序列数据库中查找有关基因的序列，再用该基因序列或其一部分作为探针筛选该基因的克隆；在自然界的长期进化过程中，一些蛋白质的基因编码序列保持着高度的保守性，因此在生物的种、属之间，基因编码序列有着很高的同源性。如果某种生物的同源基因已被克隆，则可以利用该基因或其部分序列制备探针来筛选基因文库，再对阳性克隆进行测序，并与已知基因序列或同源性序列进行比较，最后经转化鉴定是否为待分离的基因。8/14/202385第二节目的基因的分离2序列克隆法筛选2.1根据已知基因序列或同源基因序列分把滤膜放在平板上，将噬菌斑中的噬菌体颗粒影印到滤膜上，使噬菌体DNA结合在滤膜上。把滤膜放入含有放射性标记的探针的溶液中杂交。杂交后洗去膜上非结合的探针，经放射自显影确定。然后根据X线片上的放射性位点寻找相应的噬菌斑，从而分离到与探针顺序互补的目的克隆。基本过程图8/14/202386第二节目的基因的分离把滤膜放在平板上，将噬菌斑中的噬菌体颗粒影印到滤膜上，使噬菌2.2表达序列标签法分离目的基因

2.2.1概念表达序列标签(expressedsequencetag,EST)是指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度一般为100～500bp。利用EST寻找新基因的一种策略即为表达序列标签法(ESTs)。现该法已成为快速分离克隆新基因的一种有效手段。该房法研究的是被转录的基因序列。8/14/202387第二节目的基因的分离2.2表达序列标签法分离目的基因2.2.1概念8/1/22.2.2基本步骤

从组织特异性或细胞特异性的cDNA文库中随机挑选克隆，进行5‘端和3’端部分序列(约400bp)的测定。通过对核苷酸序列数据库进行联机检索，检测出所测定序列及其对应的多肽氨基酸序列与基因库中已知的基因进行同源性比较。可以通过基因文库的筛选或基因定位的方法分离目的基因。8/14/202388第二节目的基因的分离2.2.2基本步骤从组织特异性或细胞特异性的cDNA3筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术3.1差别杂交法(differentialhybridization)构建了基因文库后，如未有任何可供选择的探针进行筛选，或未有任何有关目的基因的核苷酸序列信息时，可以考虑采用差别杂交法筛选目的基因片段。特别适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，亦可有效地用来分离经特殊处理诱导表达的基因。应用前提：需要拥有两种不同的细胞群体即在一个细胞群体中目的基因能正常表达，而在另一个细胞群体中目的基因不表达。8/14/202389第二节目的基因的分离3筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术3.1差别杂交法差别杂交法：又称为差别筛选(differentialscreening)法，分别制备两种不同细胞群体的mRNA提取物，其中一种含有目的基因mRNA，另一种不含有目的基因mRNA。以这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都呈阳性反应，在X线底片上呈现黑色斑点，而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X线底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。8/14/202390第二节目的基因的分离差别杂交法：又称为差别筛选(differentialscr利用差

别杂交

法筛选

生长因

子调节

基因图8/14/202391第二节目的基因的分离利用差

别杂交

法筛选

生长因

子调节

基因图8/1/20局限性灵敏度比较低，不适用某些低丰度mRNA的目的基因的分离。这是因为在差别杂交中所使用的杂交探针是mRNA反转录成的cDNA群体。在这些同位素标记的探针中，仅有极少的一部分能与目的基因核苷酸序列完全互补，所以那些低丰度的mRNA很难用此法检测出来。十分费时耗力，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑。重复性差。差别杂交涉及文库的滤膜影印，不同滤膜之间的DNA保有量往往是不均一的，这样所得的杂交信号的强度也就不一致，需要重新进行点杂交，以作进一步的阳性克隆鉴定工作。8/14/202392第二节目的基因的分离局限性灵敏度比较低，不适用某些低丰度mRNA的目的基因的分离3.2

减法杂交技术减法杂交(subtractivehybridization)，又叫做差减杂交克隆、扣除杂交、减数杂交或消减杂交等，该技术是通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。减法杂交的对象可以是基因组DNA,也可以是cDNA，相应地称为基因组DNA减法杂交和mRNA减法杂交。前者用于克隆两样品中特异性存在的基因，后者用于分析两样品中差异表达的基因，尤其适于某些低丰度mRNA的cDNA克隆。8/14/202393第二节目的基因的分离3.2减法杂交技术减法杂交(subtractivehyb3.2.1mRNA减法杂交减法杂交的本质是尽量除去两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而使目的基因序列得到有效的富集，提高了基因筛选分离的敏感性。8/14/202394第二节目的基因的分离3.2.1mRNA减法杂交减法杂交的本质是尽量除去两种以mRNA减法杂交为例，基本原理是，从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA,然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA双链杂交分子，而特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链状态,将这种单链cDNA分离出来即为差异表达的序列。8/14/202395第二节目的基因的分离以mRNA减法杂交为例，基本原理是，从表达目的基因的组织中3.2.2基因组DNA减法杂交

可以用来分离缺失突变基因。此法的不足之处是只适于具有较大缺失突变体的基因分离。A从野生型生物体制备总DNA，用一限制酶切割成小片段。同时从缺失突变生物体制备总DNA，经超声波随机切割之后，用生物素进行标记供作驱使DNA探针。B取大大超量的该种探针，与经酶切的野生型总DNA(称为测试DNA)片段混合，经变性、复性处理后，绝大部分的无标记的野生型DNA分子同标记的突变体驱使DNA探针杂交。8/14/202396第二节目的基因的分离3.2.2基因组DNA减法杂交可以用来分离缺失突变基因。C将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱，大部分野生型的DNA分子因与突变型的生物素标记的驱使DNA探针杂交而结合到柱上，而野生型中特定的DNA片段B,由于在突变型DNA中缺失了相应的片段，故没有相应的标记的探针与之杂交，经洗脱流出。D将洗脱收集的DNA同超量的标记探针再次杂交，经过多次重复富集之后，便可克隆到该特异片段。E最后用Southern杂交法进一步鉴定，如果该片段B同野生型DNA杂交而不能与突变型生物体DNA杂交，则证明该片段确实为缺失片段。8/14/202397第二节目的基因的分离C将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱，大部分野生型的D4利用差示分析法分离目的基因克隆4.1mRNA差别显示技术(mRNAdifferentialdisplaybyPCR，DDmPCR)差别显示反转录PCR(differentialdisplayreversetranscriptionPCR，DDRT-PCR)是一种分离、鉴定差别表达基因的方法,具有与PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点。8/14/202398第二节目的基因的分离4利用差示分析法分离目的基因克隆4.1mRNA差别4.1.1mRNA差别显示技术的原理和基本程序以mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA。真核生物体mRNA的poly(A)上游的两个碱基有12种可能的排列组合。可以设计总共12种不同的下游引物，合成第一链cDNA。这种引物通常称为3’端锚定引物，它是由11～12个连续的脱氧核苷酸加上两个3’端锚定脱氧核苷酸组成，并用5’T11MN或5’-T12MN通式表示(其中M为除了T以外的任何一种核苷酸,而N则为任何一种核苷酸，故MN共有12种不同的排列组合方式)。这样，每一种此类人工合成的寡核苷酸引物，都将能够把总mRNA群体的1/12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。5’-TTTTTTTTTTMN-3’8/14/202399第二节目的基因的分离4.1.1mRNA差别显示技术的原理和基本程序以mRNA以mRNA:cDNA为模板，以一种由10个核苷酸组成的5‘端随机引物(20种)和3’端锚定引物(12种)组成的全部240组引物对作PCR扩增,可以获得20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定的mRNA种类。这个数字大体上涵盖了在一定的发育阶段某种类型细胞中所表达的全部的mRNA种类。8/14/2023100第二节目的基因的分离以mRNA:cDNA为模板，以一种由10个核苷酸组成的5‘端在PCR反应中加入放射性核素35S或32p标记反应产物。反应后,进行变性聚丙烯酰胺胶凝胶电泳，经放射性自显影在同一胶板上进行不同样品间比较，找出差异表达条带并回收差异条带，利用该片段制备探针进行cDNA文库或基因组文库的筛选，以分离该差异片段对应的全长cDNA或完整基因。

8/14/2023101在PCR反应中加入放射性核素35S或32p标记反应产物。反应随机-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。8/14/2023102随机-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的240组引物组合4.1.2过程总结图对照系组织细胞总RNA被诱导细胞差异条带回收，克隆入载体与3‘引物和5’引物进行PCR总RNA以5’T11MN为引物反转录mRNA:cDNA杂合子PCR扩增PCR产物进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳放射自显影Northern杂交鉴定差异条带的真实性差异条带的序列分析从基因组文库或cDNA文库中获得cDNA全长或基因全长进行基因功能鉴定8/14/2023103第二节目的基因的分离4.1.2过程总结图对照系组织细胞总RNA被诱导细胞差异条4.2代表性差别分析

(representationdifferenceanalysis,RDA)代表性差别分析技术的基本原理或核心内容是：充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体的复杂度和多次更换cDNA两端接头引物等方法，达到克隆基因的目的。8/14/2023104第二节目的基因的分离4.2代表性差别分析

(representationd4.2.1代表性差别分析技术流程代表性差别分析是通过突变型(驱赶DNA,driverDNA,DDNA)与野生型(检测DNA,testerDNA,TDNA)基因组之间的差异比较来分离和鉴定突变基因的方法。如以野生型基因组DNA为检测DNA,而突变型DNA为驱赶DNA,可获得缺失序列；相反以突变型DNA为检测DNA,野生型DNA为驱赶DNA,可获得重排和扩增的基因。8/14/2023105第二节目的基因的分离4.2.1代表性差别分析技术流程代表性差别分析是通过突变型①检测DNA和驱赶DNA的制备正常与突变基因组DNA经能限制性核酸内切酶作用后，再连上含有该酶酶切位点的寡核苷酸接头R24～R12，以R24为引物PCR扩增后，正常组用同一内切酶切下接头再连上另一组含有该酶酶切位点的接头J24～J12并以J24为引物PCR扩增制成检测DNA（TDNA)；突变基因组不再连上另一组接头制成驱赶DNA(DDNA)。这样检测DNA和驱赶DNA代表了基因组DNA的一部分，且由一系列小片段DNA组成，降低了基因组DNA的复杂度，使下步杂交快速和有效。8/14/2023106第二节目的基因的分离①检测DNA和驱赶DNA的制备正常与突变基因组DNA经能限制②液相杂交检测DNA和驱赶DNA按一定的比例(1:100～200)，在适当的缓冲体系中高温变性，中温(67℃)长时间复性(20h)后，90%的单链DNA都复性成稳定的双链结构，出现四种情况的组合DNA片段；检测DNA中仅有的片段自身复性;T/T检测DNA和驱赶DNA复性形成异源双链;T/D驱赶DNA自身复性;D/D检测DNA和驱赶DNA都剩一些单链。8/14/2023107第二节目的