儿童肠杆菌科细菌碳青霉烯耐药的基因型研究

儿童肠杆菌科细菌碳青霉烯耐药的基因型研究

碳青霉烯类抗生素是治疗具有特定抗生素内胺酶和酪氨酸酶等多重抗生素的最有效抗菌药物。但随着碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用及不合理使用,在儿童中出现对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株。因此本研究对从儿童临床标本中分离出20株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)进行碳青霉烯酶耐药基因研究,现将结果报道如下。1材料和方法1.1药物敏感试验细菌分离鉴定参照全国临床检验操作规程进行,Vitek2Compact全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)鉴定细菌,配套药敏卡(GN-13)对分离自儿童肠杆菌进行药物敏感试验(MIC法)检测,2013年1月至2016年2月从广西壮族自治区妇幼保健院住院儿童中共筛选出非重复厄他培南MIC浓度≥2mg/L或者美罗培南、亚胺培南的MIC浓度≥4mg/L的肠杆菌科细菌20株。体外药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603。1.2表型试验1.2.1菌株划分及生长使用无菌生理盐水将大肠埃希菌ATCC25922菌悬液调至0.5麦氏浊度,并用生理盐水进行1∶10稀释,用棉签将稀释后菌液均匀涂布于MH琼脂平皿上,干燥10min。将厄他培南纸片置于MH琼脂平皿上,使用1μL接种环挑取3~5个过夜生长待测菌落垂直于厄他培南纸片从纸片边缘开始划线,长度为20~25mm,35℃孵育16~20h。如果在被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922抑菌圈交汇处大肠埃希菌生长增强即为产碳青霉烯酶。1.2.2edta溶液的制备将待测菌或质控菌配制成0.5麦氏菌液,均匀涂布MH平皿,待干后,间隔一定距离贴两张IPM(10μg)纸片,在其中一张IPM纸片上加10μL0.5MEDTA溶液,置35℃孵育18h。加ED-TA的纸片抑菌环直径与不加EDTA的纸片抑菌环直径差值≥5mm即为阳性,判断为产金属酶。1.3细菌总dna提取参考相关文献设计并合成PCR基因引物(引物序列见表1),引物由上海英俊生物公司合成。细菌总DNA提取采用煮沸法。PCR反应,配置25μL反应总体系:反应条件为195℃5s;295℃40s;55℃40s;72℃1min,共35个循环;372℃10min。反应结束后,电泳鉴定产物。反应在梯度PCR仪(美国Biometra公司)上进行。1.4阳性克隆菌的筛选PCR产物连接pMD18-TVector(大连宝生物有限公司),转化感受态细胞,筛选阳性克隆菌,菌液PCR鉴定。由Inviotrigen公司对重组质粒的外源基因片段进行序列测定,测序结果与NCBIBlast进行比对(/blast/),确定耐药基因类型。2结果2.12产菌菌株组成20株CRE中肺炎克雷伯菌12株,占60%,4株为粘质沙雷菌占20%,3株为大肠埃希菌占15%,1株为阴沟肠杆菌占5%。标本类型主要是痰液占70%,其次是血液占20%,菌株主要分布于新生儿科和儿童重症监护病房。2.2亚胺培南的药物中介作用抗菌药物敏感性结果显示,所有菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢曲松耐药(100%);亚胺培南的中介率(5%),耐药(85%);厄他培南中介率(10.00%),耐药(80.00%);阿米卡星、环丙沙星100%敏感,见表2。2.3cre耐药基因型检测结果CRE耐药表型检测结果:20株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌改良Hodge试验阳性14株(70%),IPM+EDTA纸片增效试验阳性17株(85%),ESBLs阳性率15%。以PCR方法为金标准,改良Hodge试验对20株CRE的碳青霉烯酶的检出敏感性和特异性分别是73.68%(14/19)和100%(1/1)。假阳性0株,假阴性5株,假阴性率25%,准确性75%。IPM+EDTA纸片增效试验敏感性和特异性分别是89.47%(17/19)和100%(1/1)。假阳性0株,假阴性2株,假阴性率10%,准确性90%。ESBLs阳性率15%。CRE耐药基因型检测结果:对20株CRE菌株中的碳青霉烯酶基因、EsBLsβ-内酰胺酶基因进行扩增,12株肺炎克雷伯菌、4株粘质沙雷菌、2株大肠埃希菌、1株阴沟肠杆菌中均检出IMP基因,阳性率95%。碳青霉烯酶基因扩增结果见图1。所有菌株未检出KPC、GES、SME、NMC、IMC、NDM-1、VIM、SIM型碳青霉烯酶基因。编码ESBLs酶的基因中产TEM型ES-BLs酶的菌株19株(95%),SHV型ESBLs酶17株(85%),未检测出CTX-M-1、CTX-M-13型ESBLs酶的菌株,见表3。2.4结果表明，对序列结果和序列分析对19株产IMP金属酶的PCR阳性产物进行基因测序分析,测序结果经与NCBIBlast比对,确认为bla3碳青霉烯酶基因检测儿童CRE以肺炎克雷伯菌为主,产IMP-4型碳青霉烯酶出现在肠杆菌科细菌的不同菌株,产IMP-4型碳青霉烯酶是儿童临床分离耐CRE主要型别,未检测出KPC、GES、SME、NMC、IMC、NDM-1、VIM、SIM型碳青霉烯酶基因。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制主要是产碳青霉烯酶,高产AmpC酶、ESBLs也可导致其耐药。本研究的儿童CRE大多数菌株同时也存在超广谱β内酰胺酶TEM、SHV基因。超广谱β内酰胺酶CTX-1、CTX-13基因是西南地区超广谱β内酰胺酶CTX-M基因常见基因型B类金属酶包含VIM、IMP、SIM-1、KHM