产金属-内酰胺酶铜绿假单胞菌的检测及耐药性分析

产金属-内酰胺酶铜绿假单胞菌的检测及耐药性分析

铜绿假单胞菌是常见的临床感染病原体。近年的研究表明,临床使用碳青霉烯类药物治疗多重耐药铜绿假单胞菌感染时,发现耐亚胺培南的铜绿假单胞菌逐年增多,产金属β-内酰胺酶(metallo-beta-lactamase,MBL)菌株已成为目前耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制研究中的热点。本研究对30株耐亚胺培南铜绿假单胞菌进行金属酶表型分析,同时检测bla11.1材料表面1.1.1筛选待测菌株收集2006-08/2007-02临床分离的铜绿假单胞菌,并经K-B法筛选对亚胺培南耐药株作为待测菌株,共计30株。铜绿假单胞菌ATCC27853作为阴性质控菌,购于山东省临床检验中心,铜绿假单胞菌产IMP-1型和VIM-2型金属酶的阳性对照菌株由上海交通大学医学院附属瑞金医院惠赠。1.1.2仪器和主要试剂7600型DNA扩增仪(美国PE公司);EDTA-Na1.2方法1.2.1细菌的鉴定用法国生物梅里埃公司ATBExpressionID32GN鉴定系统操作。1.2.2e-todta和ipm对菌株k-b法药敏试验结果EDTA纸片复合法以亚胺培南为金属β-内酰胺酶底物,以EDTA-NaEDTA-Na将受试细菌制成0.5麦氏浊度的菌液,在直径90mm的M-H琼脂平板上涂布受试细菌,按K-B法药敏试验方法,采用亚胺培南(IPM,10μg)纸片,并将500mmol/LEDTA10μl加至上述纸片制得IPM/EDTA纸片,按K-B纸片法测出IPM,IPM/EDTA纸片的抑菌圈直径。EDTA能使相应抗菌药物的抑菌圈直径扩大≥5mm者E-test法检测:在直径90mm的M-H琼脂平板上,按K-B法药敏试验方法接种待测菌后,在正中帖上IP/IPIE-testMBL试纸条,MIC刻度面朝上,35℃温箱孵育16～18h,观察结果。E-test金属β-内酰胺酶试验条由两边7倍稀释范围的IPM(4～256μg/ml)和上面覆盖有EDTA的IPM(1～64μg/ml)构成。用铜绿假单胞菌ATCC27853作为阴性质控菌,质控范围:(IP)IPMMIC≤4μg/ml,(IPI)IPM+EDTAMIC在1～4μg/ml;测试菌株结果判断标准为:如果IP/IPI≥3倍稀释度为阳性1.2.3蛋白酶k溶液蛋白酶K消化法:挑取过夜纯培养菌落置入0.5ml离心管(内已预制200ng/ml蛋白酶K溶液),56℃水浴2h,改95℃水浴10min。15000r/min离心30s,取上清液移入另一新的0.5ml离心管作为模板液,置入-20℃冰箱备用。1.2.4pcr和引物扩增所用引物参照GenbankblaGCTTGGTTTTGATGG-3’,产物长度为741bp;VIM-F:5’-ATGTTCAAACTTTTGAGTAA-3’,VIM-R:5’-CTACTCAACGACTGAGC-3’,产物长度为801bp。PCR引物委托大连宝生物工程有限公司合成。PCR反应体系25μl:Taq(5U/μl)0.2μl,10×PCRBuffer2.5μl,dNTPMixture2μl,模板DNA2μl,引物F(20μmol/L)0.5μl,引物R(20μmol/L)0.5μl,灭菌蒸馏水(ddHblaPCR全过程以产IMP-1型金属酶铜绿假单胞菌菌株做为扩增bla1.2.5菌株质控菌株抗菌药物共有8种,分别是亚胺培南(IPM)、头孢他啶(CAZ)、头孢哌酮(CFP)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、环丙沙星(CIP)、氨曲南(ATM)、左氧氟沙星(LEV),质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。结果解释标准参照2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSL)的临界值22.1-内酰胺酶诱导剂的结果30株耐亚胺培南铜绿假单胞菌,EDTA纸片复合法筛选9株产金属酶菌株;E-test法筛选6株产金属酶菌株。见表1。2.2抗癫痫基因的检测目标基因bla2.3内酰胺金属丝的mic值见表2。3金属酶检测药物抗菌活性应符合以下5铜绿假单胞菌是引起院内感染的条件病原菌之一,其对多种抗生素易产生耐药性,使治疗十分困难。以往对铜绿假单胞菌耐药机制的研究中,多是该菌产染色体介导的AmpC酶和(或)外膜渗透性降低或抗生素泵出机制,并发现铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制主要是外膜孔蛋白OprD2缺失引起的金属β-内酰胺酶又称金属酶,它属于Ambler分子结构分类中的B类和Bush功能分类中的第3组。金属酶能水解除单环类抗菌药物以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素,使细菌对青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类耐药。1991年日本学者Osano等金属β-内酰胺酶耐药基因由染色体或质粒介导。IMP-1基因大多数位于质粒上,而VIM-2基因主要存在于染色体上,仅少数存在于质粒上本研究采用微量肉汤稀释法检测8种抗菌药物对产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的MIC值,结果提示产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌对头孢他啶(MIC≥64μg/ml)、亚胺培南(MIC≥32μg/ml)耐药大多表现为高水平耐药。上述资料可以看出产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌选择抗菌药物的范围很窄,阿米卡星抗菌活性最好,其次为环丙沙星。阿米卡星对铜绿假单胞菌产生的氨基糖苷类钝化酶较稳定,具有良好的抗菌活性,但氨基糖苷类药物有耳、肾毒性,临床应用中应注意监测。治疗多重耐