牛上皮细胞中有效表面标记物的筛选

牛上皮细胞中有效表面标记物的筛选王燕琴;王易之;智宇【摘要】动物上皮细胞容易被多种病毒感染,上皮细胞表面标记物的检测可以作为表征上皮细胞状态的一种手段,但是大多数上皮细胞表面标记物也会在上皮来源的肿瘤细胞中表达.为了选择高效、独特的上皮标记物,采用蛋白质印迹法和间接免疫荧光技术，在牛肾上皮细胞(KE)、舌上皮细胞(TE)、甲状腺上皮细胞(TYE)以及A549细胞和SW480细胞中，检测了AE3(basiccytokeratin)、AE5(CK3/2p)、CK7、LH1(CK1/10)、EMA(epithelialmembraneantigen)、DesmoplakinI/口(DSPI/口)、E-cadherin和ZO1(zonaoccludens-1)等8种上皮标记物的表达•结果显示，与阴性对照相比,AE3、AE5、CK7、EMA及DSPI/H在上皮细胞和上皮细胞来源的A549、SW480肿瘤细胞中表达良好；E-cadherin仅在上皮细胞中表达;LH1(CK1/10)和ZO1在所有被检测的细胞中都没有表达•结果表明,AE3、AE5、CK7、EMA及DSPI/口可以作为有效的上皮细胞及上皮来源的肿瘤细胞标记物,E-cadherin可以作为特异性的上皮细胞标记物.【期刊名称】《动物医学进展》年(卷),期】2019(040)007【总页数】6页(P77-82)【关键词】上皮细胞;肿瘤细胞;表面标记物;间接免疫荧光;细胞角蛋白;细胞紧密连接【作者】王燕琴;王易之;智宇【作者单位】内蒙古集宁师范学院,内蒙古乌兰察布012000;西北农林科技大学,陕西杨凌712000;西北农林科技大学,陕西杨凌712000;内蒙古自治区农牧业科学院,内蒙古呼和浩特010051【正文语种】中文【中图分类】S852.33;S857.4上皮细胞在许多病毒复制过程中可通过模式识别受体感应病毒的病原相关分子模式,从而识别病毒,并启动抗病毒固有免疫应答。上皮细胞常常被用作模式细胞，而上皮细胞的鉴定通常要到表面标记物。上皮细胞中含有大量亚型的特异性标记物。常用的上皮细胞表面标记物包括细胞角蛋白(cytokeratin,CK)、上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen,EMA)、E-cadherin和Desmoplins(DSP)。CK是上皮细胞生长、分化及成熟的特征性标志物，角膜再生医学组织工程上皮细胞片利用AE5(cytokeratin3/2p)和ZO1(cytokeratin1/10)抗体作为上皮标记物，涉及到角膜的实验则大多采用AE5作为标志物。ZO1和E-cadherin也常被用作标记物来检测上皮细胞是否丢失［1］。DSP是上皮细胞和心肌细胞间质斑块中主要的蛋白质。上皮细胞标记物也会在上皮来源的肿瘤细胞中高效表达。比如，EMA是一种广泛表达于上皮组织的抗原，也是正常脑膜和所有肿瘤的阳性抗原［2］。卵巢周围原始神经外胚层恶性肿瘤检测时采用AE1和AE3作为表面标记物;脊索瘤细胞表达CK和上皮膜抗原(EMA)；肾外恶性横纹肌瘤细胞表达EMA,AE3。CK和EMA可以在乳腺癌［3］、血管肉瘤［4］、平滑肌肉瘤［5］、乳头状甲状腺癌［6］等多种肿瘤细胞中表达。CK7和EMA在子宫内膜样腺癌和透明细胞癌中普遍为阳性。本研究比较这8种常用的上皮细胞表面标记物在肾上皮细胞(kidneyepithelialcell，KE)、舌上皮细胞(tongueepithelialcell，TE)、甲状腺上皮细胞(thyroidepithelialcell,TYE)以及腺癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)和人结肠癌细胞(SW480)中的表达效率，旨在选择高效、特异性高的上皮细胞表面标记物。材料与方法材料1.1.1细胞和培养基SW480和A549细胞，购自ACCA公司；牛肾脏、舌和甲状腺组织，采集自西安中乐屠宰场，按照文献［7］中的方法分离上皮细胞；培养基为DMEM/F12培养基(补充100mL/L的新生牛血清,2mmol/LL-谷氨酰胺,10ng/mL表皮生长因子,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素)。1.1.2试剂DMEM/F12粉末，SIGMA公司产品；胎牛血清，Hyclone公司产品；表皮生长因子，北京灵宝公司产品；L-谷氨酰胺，西安拉维亚生物科技有限公司产品。1.1.3抗体Anti-Cytokeratin3/2p(AE5:sc-80000)、anti-BasicCytokeratin(AE3:sc-57004)、anti-Cytokeratin1/10(LH1:sc-53251)、anti-E-cadherin(S17:sc-31020)、anti-Cytokeratin7(5F282:sc-70936)，SantaCruz生物公司产品；anti-EMA(2F6:ab156947)、anti-DesmoplakinI+H(ab71690)santi-ZO1(ab59720)抗体，Abcam生物公司产品。方法1.2.1间接免疫荧光试验大约2x104的细胞滴加于盖玻片上，置于12孔细胞培养板内培养12h。吸去上清液，在室温下以40mg/mL多聚甲醛固定细胞10min。PBS洗涤细胞后，以封闭液(50mg/mL牛血清白蛋白，2mL/LtritonX100PBS)封闭/通透30min。加入一抗，孵育2h后以PBS洗涤3次。加入Cy3标记的山羊抗兔IgG,室温孵育1h;用PBS洗3次，加入Hochest后避光孵育5min~10min;于荧光显微镜条件下观察。1.2.2免疫印迹分析采用全细胞蛋白裂解液进行Westernblot分析。即将6孔培养板内的细胞加2.5mg/mL胰酶消化并将细胞收集到1.5mL离心管中，300r/min离心5min。弃上清，加入100pLRIPA细胞裂解液(加入蛋白酶抑制剂混合物)提取。用BCA蛋白定量试剂盒对样品的总蛋白进行定量，用RIPA调各样品浓度至一致。样品中加入等体积的2xSDS样品缓冲液,100°C煮10min，置-20C或-70C保存样品。根据分子克隆指南中描述的SDS配制方法配制120g/L的分离胶和50g/L浓缩胶并进行电泳。待溴酚蓝到达胶的底端附近时停止电泳，取出蛋白胶，进行转膜。转膜完成后，以TBST洗去转膜液和残留的凝胶。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭2h。取出后，分别加入稀释的一抗，4C过夜孵育。加入TBST洗膜3次。加入稀释的二抗，室温下孵育2h,以TBST洗膜3次。参考说明书，使用化学发光检测试剂盒检测目的蛋白，用X光胶片曝光的方式记录试验结果。结果经过分离，分别得到了牛肾上皮细胞(KE)、舌上皮细胞(TE)和甲状腺上皮细胞(TYE)(图1)，并将它们用于后续的上皮细胞标记物筛选。AE3、AE5、CK7在上皮细胞和上皮来源的肿瘤细胞中表达细胞角蛋白在特定组织中的表达模式可以作为上皮分化的标志。试验检测了细胞角蛋白AE3、AE5、CK7以及LH1在3种上皮细胞(KE、TE和TYE)和2种肿瘤细胞(A549、SW480)中的表达。AE3、AE5和CK7在上皮细胞和肿瘤细胞中高效表达间接免疫荧光结果(图2)显示：在被检的3种上皮细胞中，AE3、AE5和CK7肾上皮细胞中的荧光强度显著低于它们在牛舌上皮细胞和牛甲状腺上皮细胞中的强度。在KE中，CK7的强度高于AE3和AE5;在TE中，AE3、AE5和CK7的荧光强度都很高，且强度基本一致；在TYE中，AE3和CK7的荧光强度高于AE5。相对于上皮细胞来说，肿瘤细胞中检测到的荧光强度比较低。在A549和SW480细胞中，AE3、AE5和CK7均检测到荧光信号，且信号强度比较一致。在3种CK中，AE3和CK7的荧光强度大于AE5，这一点与上皮细胞中的结果一致。Westernblot结果显示,AE3和CK7在KE、TE、TYE、A549及SW480细胞中表达量高于AE5；CK7在SW480细胞中的表达量低于其他被检细胞（图3）。LH1在上皮细胞和肿瘤细胞中表达量低与其他3种CK不同，在正常上皮细胞（KE、TE、TYE）和肿瘤细胞（A549及SW480）中均未检测到LH1的荧光表达。Westernblot在KE、TE、TYE中仅有微量的LH1蛋白表达被检测到。KE.肾上皮细胞；TE.舌上皮细胞；TYE•甲状腺上皮细胞KE.Kidneyepithelialcell；TE.Tongueepithelialcell；TYE.Thyroidepithelialcell图13种牛上皮细胞Fig.1Threekindsofbovineepithelialcells图2上皮细胞及肿瘤细胞的间接免疫荧光染色结果Fig.2IndirectimmunofluorescencestainingresultsofepithelialcellsandtumorcellsDSPI/H在上皮细胞和肿瘤细胞中高效表达DSPI和DSP口是定位于桥粒斑块最内侧的高度相关蛋白，是连接中间丝和桥粒复合体的候选蛋白°DSPI存在于所有上皮细胞中,DSP口表达于牛、猪、猴和人除甲状腺滤泡上皮外的所有被检上皮细胞中。间接免疫荧光结果（图2）显示，DSPI/n在上皮细胞中的荧光强度高于肿瘤细胞。其中，TE、TYE的荧光强度高于KE,SW480中的荧光强度高于A549。Westernblot检测（图3）显示，KE、TE、TYE、A549中均检测到DSPI/H的表达，SW480中仅有DSPI的表达。EMA在上皮细胞和肿瘤细胞中高效表达上皮细胞膜抗原（EMA）或MUC1属于一组高度糖基化的异质性蛋白，在大多数正常和上皮肿瘤细胞中表达。EMA也表达于浆细胞、肿瘤大细胞淋巴瘤（Ki-1抗原）、恶性组织细胞病和红血球白血病中。因此EMA既可以作为上皮细胞标志物，又可以用于肿瘤的组织学预后标准。检测了EMA的表达，结果如图2和图3。在KETE、TYE、A549和SW480均检测到了EMA的荧光表达。与CK和DSP不同，EMA在上皮细胞和肿瘤细胞中的荧光强度区别不明显，在TYE和SW480中的荧光强度高于其他3种细胞。应用Westernblot法，在5种细胞中均检测到了EMA的表达。E-Cadherin仅在上皮细胞中表达E-cadherin是一种Ca2+依赖性的细胞黏附分子。它对细胞黏附功能的完整至关重要，并在上皮细胞形态和分化的建立与维持中发挥作用。如图2和3所示，试验仅在上皮细胞中检测到E-cadherin的表达，TE细胞中E-cadherin的强度高于KE和TYE,A549和SW480细胞中未检测到E-cadherin的荧光信号。Westernblot检测结果显示，仅上皮细胞KE、TE、TYE中由E-cadherin的表达，KE和TYE的表达量要高于TE。图3上皮细胞及肿瘤细胞的蛋白印迹结果Fig.3WesternblotresultsofepithelialcellsandtumorcellsZO1在上皮细胞和上皮来源的肿瘤细胞中均不表达胞质紧密黏连蛋白ZO1是骨架蛋白，形成紧密连接膜的分子可以附着在ZO1上角膜再生医学组织工程中，常常利用AE5和ZO1抗体作为上皮标记物。在上皮细胞和上皮来源的肿瘤细胞中的免疫荧光和蛋白质印迹试验中，均未检测到ZO1的表达（图2和3）。讨论角蛋白是一种结构蛋白，分为硬角蛋白和软角蛋白；软角蛋白也被称为细胞角蛋白（CKs）。CKs主要在上皮细胞中表达，分为I型和口型角蛋白。I型角蛋白，即CKs9-20,呈酸性，分子质量为40ku~64ku。口型角蛋白，即CKs1-8，是中性到碱性的，分子量从52ku~68ku不等［8］。细胞角蛋白多肽的模式具有特定组织或细胞类型的特征，或具有上皮组织相关群的特征，使其成为细胞骨架蛋白标志物［9-11］。每一种上皮类型都有明显的细胞角蛋白多肽结构，可以用来区分简单和复杂的上皮细胞。CK1~3由鳞状上皮细胞表达，CK5和CK6由间皮细胞特异性表达。非角质化的分层上皮如颊黏膜和肺泡黏膜表达CK4和CK13，同时表达CK5和CK14。至U目前为止，研究者们还未发现具有相同的细胞骨架多肽模式的两种上皮组织。以前的研究表明角质化的分层上皮如舌、腭和皮肤表达CKs1和CKs10,同时表达CKs5和CKs14。本试验只检测到了AE3、AE5、CK7在上皮细胞和肿瘤细胞中的表达，未检测到LH1的表达。Franke等检测了不同上皮组织之间、不同表皮层之间以及不同培养上皮细胞之间的细胞角蛋白组成的差异。发现大多数被测样本中的差异不是由于蛋白水解降解造成的，而是合成细胞角蛋白成分的差异。CK3常常被用作角膜上皮细胞分化的标志物，而CK7是已经被公认的准确的细胞内标记物［12］。与正常的上皮组织相比，在良性和恶性肿瘤中，细胞角蛋白多肽表达的变化也已经被观察到。在癌症中，角蛋白被广泛用作诊断性肿瘤标志物，因为上皮恶性肿瘤在很大程度上维持与它们各自的起源细胞相关的特定角蛋白模式，而且在许多情况下，肿瘤和/或外周血中全长或裂口角蛋白表达（或缺乏）对癌症患者具有预后意义［13］。由于它们的差异依赖性和组织特异性表达，也被用作诊断包括癌症在内的各种上皮疾病的标志物［14］。比如，黑尔胶态铁染色是形态学解释的有力辅助，但它不是特异性的。当黑尔胶态铁染色不确定时，CK7的免疫组织化学染色可用于鉴别诊断肾细胞癌和肾嗜酸细胞瘤［15］。EMA可以在上皮细胞和上皮肿瘤细胞中表达。大多数上皮肿瘤（包括鳞状细胞癌、乳腺癌和大细胞肺癌）也可以与EMA抗体反应。因此相比于作为上皮细胞表面标记物，EMA更常被用作肿瘤诊断标志物。比如，联合使用胰岛素样生长因子口mRNA结合蛋白3(IMP3)和EMA比单独使用IMP3或EMA更有助于区分恶性间皮瘤和良性间皮瘤［16］。EMA/CK1比值的差异可作为早期乳腺癌患者的诊断指标。CK7和EMA结合的免疫染色可以鉴别胆管缺失和导管增生［17］。上皮细胞彼此间通过一组复合物连接,包括黏附连接、紧密连接和细胞桥粒［18］。黏附连接由跨膜蛋白E-cadherin和胞浆蛋白catenin介导，定位于邻近的细胞。本研究表明，E-cadherin在3种正常上皮细胞中均正常存在。E-cadherin最早是在受精卵中就表达，是胚胎第一个形成的上皮细胞-胚泡发育所必需的。E-cadherin与细胞极化表型的建立和紧密黏附连接的形成有关。除去作为表面标志物被应用，E-cadherin在体内的作用也被广泛研究。比如，它可以作为血小板聚集和血栓稳定性的调节因子。E-cadherin通过信号传导和机械机制抑制肉瘤中与锚定无关的生长［19］。Von等在更大范围的甲状腺肿瘤中研究了E-cadherin的表达，发现E-cadherin的表达似乎与甲状腺癌的去分化进展和扩散有关。紧密连接是细胞间连接的最外层结构，属于跨膜蛋白。形成紧密连接膜的分子附着在Z01、Z0-2和ZO-3等骨架蛋白上，通过这些骨架蛋白信号被介导到细胞内部。本研究未检测到ZO1在上皮细胞和肿瘤细胞中的表达，说明ZO1可能并不适合于作为上皮细胞标记物。现在对ZO1的研究主要是它在生命发展过程中的作用。血红素加氧酶通过调控紧密连接蛋白ZO1,可以提高胎盘滋养细胞的侵袭能力。某些类型的肿瘤表现为ZO1表达下调，在肿瘤进展中起重要作用。过表达ZO1抑制细胞活力、增殖和迁移，诱导G/G相阻滞［20］。DSP是血小板溶素家族的一种细胞连接蛋白，是细胞间黏附复合物桥粒的重要细胞内成分°DSPI和DSP口在溶解度特性、等电点、胰蛋白酶图谱、氨基酸组成、免疫学标准等方面的相似性决定了它们是密切相关的。研究表明，它们可能来源于—个基因的2个mRNA［21］。VasioukhinV等［22］特异性敲除表皮中的DSP后，发现表皮完整性需要DSP；机械应力能够导致无DSP皮肤的细胞间分离。本研究结果表明dspi/h在上皮细胞及上皮细胞性的肿瘤细胞中表达量很高。但研究者很少将DSPI/口用作标记物。现在的研究主要集中于DSP与不同的中间丝类型相互作用，如DSP在斑马鱼早期胚胎发育中的作用［23］。副肿瘤性天疱疮自身抗体可以与存在于细胞连接处的蛋白质，如DSP及其他蛋白发生反应。如南美哥伦比亚地区受地方性叶落天疱疮新变种影响的患者，其自身抗体与MYZAP、p0071、DSPI/口和ARVCF共定位，可以引起肾脏损害［24］。本研究结果表明，AE3、AE5、CK7、EMA以及DSP等5种标记物，不但可以在上皮细胞中表达，而且可以在上皮来源的肿瘤细胞中高效表达。相应的，E-cadherin只在上皮细胞中表达，因此可以作为有效的上皮细胞标记物来筛选、标记细胞。参考文献:【相关文献】MellasRE,LeighNJ,NelsonJW,etal.ZO-1,Occludin,andE-cadherinexpressionandorganizationinsalivaryglandswithSjogren'ssyndrome[J].ActaHistochemicaEtCytochemicaOffJJpnSociHistochemCytochem,2014,63(1):45-56.SloaneJP,OrmerodMG.Distributionofepithelialmembraneantigeninnormalandneoplastictissuesanditsvalueindiagnostictumorpathology[J].Cancer,1981,47(7):1786-1795.AttallahAM,El-FarM,OmranMM,etal.Circulatinglevelsandclinicalimplicationsofepithelialmembraneantigenandcytokeratin-1inwomenwithbreastcancer:cantheirratioimprovetheresults?[J].TumorBiol,2014,35(11):10737-10745.Al-AbbadiMA,AlmasriNM,Al-QuranS,etal.Cytokeratinandepithelialmembraneantigenexpressioninangiosarcomas:Animmunohistochemicalstudyof33cases[J].ArchPatholLabMed,2007,131(2):288-292.IwataJ,FletcherCDM.Immunohistochemicaldetectionofcytokeratinandepithelialmembraneantigeninleiomyosarcoma:Asystematicstudyof100cases[J].PatholInter,2010,50(1):7-14.TrivinoLopezA,CarlosGonzalezI,YamamotoY,etal.Animmunohistochemicalstudyofepithelialmembraneantigen,cytokeratin,andvimentininpapillarythyroidcarcinoma:Recognitionoflethalandfavorableprognostictypes[J].Cancer(Philadelphia),1993,72(7):2286-2287.RongW,YingHE,LiL,etal.Comparisonoftwomethodsforprimarycultureofepithelialcellsfromhumanbioptictissueofnasopharyngealcarcinoma[J].JSouthMedUniv,2010,30(12):2667-2670.MollR.Cytokeratinsasmarkersofdifferentiation.Expressionprofilesinepitheliaandepithelialtumors[J].VeroffPathol,1993,142:1.FrankeWW,SchillerDL,MollR,etal.Diversityofcytokeratins:Differentiationspecificexpressionofcytokeratinpolypeptidesinepithelialcellsandtissues[J].JMolBiol,1981,153(4):933-959.BarakV,GoikeH,PanaretakisKW,etal.Clinicalutilityofcytokeratinsastumormarkers.[J].ClinBiochem,2004,37(7):529-540.TotT.Cytokeratins20and7asbiomarkers:usefulnessindiscriminatingprimaryfrommetastaticadenocarcinoma[J].EurJCancer,2002,38(6):0-763.SherwoodER,BergLA,MitchellNJ,etal.Differentialcytokeratinexpressioninnormal,hyperplasticandmalignantepithelialcellsfromhumanprostate[J].JUrol,1990,143(1):167-171.KarantzaV.Keratinsinhealthandcancer:morethanmereepithelialcellmarkers[J].Oncogene,2011,30(2):127-138.RaulU,SawantS,DangeP,etal.Implicationsofcytokeratin8/18filamentformationinstratifiedepithelialcells:Inductionoftransformedphenotype[J].InterJCancer,2010,111(5):662-668.LeroyX,MoukassaD,CopinMC,etal.Utilityofcytokeratin7fordistinguishingchromophoberenalcellcarcinomafromrenaloncocytoma[J].EurUrol,2000,37(4):484-487.ChangS,OhMH,JiSY,etal.Practicalutilityofinsulin-likegrowthfactorIImRNA-bindingprotein3,glucosetransporter1,andepithelialmembraneantigenfordistinguishingmalignantmesotheliomasfrombenignmesothelialproliferations[J].PatholInter,2015,64(12):607-612.HermanHK,Abramowsky