微生物发酵制药技术基础-发酵过程控制

单元二微生物发酵制药技术基础项目六发酵过程控制任务二发酵过程中温度的控制1.温度对代谢的影响影响微生物生长（连续进行酶反应的过程）影响产物合成（一系列酶促反应的结果）影响生物合成的方向例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。2.影响发酵液的物理性质（一）温度对发酵的影响（二）发酵热引起温度的变化产热因素：生物热搅拌热散热因素：蒸发热辐射热Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射1.生物热：生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为CO2、NH3时释放出的大量能量。用途：合成高能化合物供微生物生命代谢活动热能散发影响生物热的因素：菌株、培养基、发酵时期的不同。还与菌体的呼吸强度有对应关系。2.搅拌热：通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间、液体与设备之间的摩擦而产生热。

Q搅拌=3600（P/V）3600：热功当量（kJ/（kW.h））（P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（kW/m3）3.蒸发热空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换，除了部分氧气被微生物利用外，大部分气体（称为尾气）仍旧排放出反应器，从而引起热量的散发。尾气与发酵液接触的过程中，进入的空气湿度增加，水分随着尾气一起被排除，同时伴随热量传递，这一部分热量，称之为蒸发热。4.辐射热由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量，即为辐射热。辐射热的大小取决于罐内温度与外界气温的差值，差值愈大，散热愈多。（三）温度的检测传统上用玻璃温度计测量发酵温度。一般将金属套管插入发酵罐并焊接固定在发酵罐壁上，再在金属套管内装有传热性好且不易挥发的液体介质，将玻璃温度计插入金属套管并浸泡于液体介质中，测量温度。目前普遍采用热电偶测定发酵温度。由于铂电阻、铜电阻等热敏电阻在一定温度范围内对温度有较好的线性响应的电阻值，所以热电偶由热敏电阻作为感温元件装在金属套管内制作而成。1.最适温度的选择是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。不同微生物的发酵最适温度可能不同，同一种微生物在不同发酵阶段的发酵最适温度也有可能不同，或有可能在不同培养条件下的发酵最适温度不同。如谷氨酸产生菌的最适生长温度为30～34℃，产生谷氨酸的最适温度为36～37℃。。（四）温度的控制最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。根据发酵阶段选择不同的培养温度。生长阶段选择最适生长温度；产物生成阶段选择最适生产温度。工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，而需要冷却的情况较多。利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇形管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵。2.温度的控制发酵过程的自动控制是借助于自动化仪表和计算机组成的控制器，控制一些发酵的关键变量，达到控制发酵过程的目的。如发酵温度的开关控制系统就是通过温度传感器检测发酵罐内温度，如温度低于设定点，冷水阀关闭，蒸汽或热水阀打开；如温度高于设定点，蒸汽或热水阀关闭，冷水阀打开。控制阀的动作是全开或全关，所以称为开关控制。单元二微生物发酵制药技术基础项目六发酵过程控制任务六补料的控制（一）补料的目的

避免高浓度底物的不良影响，又可以使产物合成的旺盛期延长，达到提高发酵产量的目的。（二）补料的方式1.间歇流加间歇流加是指在发酵过程中，补充的物料分成若干次流加到发酵罐中。当培养基某一底物的浓度降低到某一水平时，就开始第一次补料，补料以后该底物浓度会有所升高，由于微生物继续消耗，该底物浓度将再次降低，于是进行第二次补料，以此类推，直至发酵结束。少量多次流加为原则2.连续流加连续流加是指在发酵过程中，补充的物料连续流加进入发酵罐中。流加过程中控制好料液的流速，尽量使底物的消耗速率等于底物的补充速率，这样，该底物浓度就可以维持相对稳定（三）补料的时间通常在微生物细胞进入产物合成期以后才开始补料。在适当的残留底物浓度开始补料。补料时间既要控制在产物合成期，又要控制在适当的残留底物浓度，这要求配制培养基时，初始底物浓度要控制适当。（四）补料的内容1.能源和碳源2.氮源3.无机盐、前体和促进剂4.水单元二微生物发酵制药技术基础项目六发酵过程控制任务七发酵终点的判断发酵终点的判断，对提高产物的生产能力和经济效益很重要。生产能力（或称生产率、产率）是指单位时间内发酵罐单位体积发酵液的产物积累量

经济因素：生产率和成本。最低的成本获得最大生产率。产品质量因素：放罐时间对下游工序影响很大。特殊因素：染菌、代谢异常等。合理的放罐时间是由实验来确定的，即根据不同的发酵时间所得的产物产量计算出发酵罐的生产率和产品成本，采用生产率高而成本又低的时间，作为放罐时间。不同的发酵类型，要求达到的目标不同，因而对发酵终点的判断标准也有所不同。一般对发酵和原材料成本占整个生产成本主要部分的发酵产品，主要追求提高生产率、得率（kg产物/kg基质）和发酵系数[kg产物/（罐容m3·发酵周期h）]。另外，放罐时间对下游工序有很大影响单元二微生物发酵制药技术基础项目六发酵过程控制任务三发酵过程中pH的控制（一）pH对发酵的影响1.pH对代谢的影响pH值影响微生物生长和合成代谢所需酶的活性pH影响生物合成途径方向例如：黑曲霉在pH2-3时，发酵产生柠檬酸，在pH接近中性时，则产生草酸。2.pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性3.影响培养基某些组分和中间产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。（二）发酵过程中pH的变化

发酵过程中pH的变化取决于微生物的种类、培养基的组成和发酵条件。在菌体代谢过程中，菌体本身有建成其生长最适pH的能力，但外界条件发生较大变化时，pH将会不断波动。1.培养基中碳氮比例不当碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降。如果培养基中氮源过多，这些物质被分解利用，氨基氮释放，使pH上升。培养基内的生理碱性物质，被微生物利用后，均会产生大量的碱性物质，使发酵液的pH值上升。2.不同发酵阶段pH值不同微生物的不同发酵阶段，其pH值的变化也各不相同。在发酵前期，主要是微生物的生长、繁殖，随菌种特征不同，发酵的pH值有上升或下降的趋势。

在代谢产物的合成阶段，微生物菌体生长繁殖减缓，分解碳、氮源物质的能力减弱，使发酵液中的pH值比较稳定。（三）pH的检测1.取样罐外测量

有试纸法（精密级）；pH电极法。罐外取样测量不利于实现自动化管理。目前，现代化的生产企业大部分是采用pH值的在线（online）检测、控制方式，其核心部件是pH检测的电极，外加不锈钢护套后安装于罐内另外有pH显示仪表。同时可以与控制仪表连接，通过回路系统控制阀门或给料泵送入酸或碱进行pH调节。

2.在线测量这种电极不同于普通的pH检测电极，其基本要求是：耐高温、经受120℃以上高温、60min的处理；需要有压力、温度补偿系统。1.通过调节培养基组分比例来调节pH值发酵后pH值产生变化，可以通过调节补料中的配备比例来达到补充基质和调节pH值的双重目的。一般情况下碳的比例加大，将使发酵液的pH值下降；氮的比例加大，则易使发酵液的pH值上升。（四）发酵过程中pH的控制2.在培养基中加入适量的缓冲剂发酵生产中较常用的缓冲剂是CaCO3。

3.直接用酸碱来调节常用的碱为氨水，加氨水的方法通称为通氨工艺。常用的酸为硫酸。单元二微生物发酵制药技术基础项目六发酵过程控制任务四发酵过程中溶解氧的控制好气性微生物的生长发育和代谢活动都需要消耗氧气。微生物只能利用溶解于液体中的氧。实验室中，通过摇瓶机往复运动或偏心旋转运动供氧。中试规模和生产规模的培养装置采用通入无菌压缩空气并同时进行搅拌的方式。通气的目的：供给微生物生长和代谢所需的氧气搅拌的目的：促进混合及传质（特别是氧传质）（一）微生物对氧的需求1.比耗氧速率-呼吸强度单位质量的干细胞在单位时间内消耗氧的量，以QO2

表示。—比耗氧速率或呼吸强度，（molO2/kg干细胞·S）；

—最大比耗氧速率，（molO2/kg干细胞·S）；CL—溶氧氧浓度，（molO2/m3）；ko—氧的米氏常数，（molO2/m3），其表示比耗氧速率为最大比耗氧速率一半时的溶解氧的浓度。k0特征：k0越大，亲和能力越小，QO2越小。2.摄氧率γ（耗氧速率）单位体积培养液在单位时间内消耗氧的量，以r表示。式中：—发酵液中细胞浓度，（kg干细胞/m3培养液）；

—摄氧率，（molO2/m3·S）。（二）影响微生物需氧量的因素1.微生物种类和生长阶段生长阶段培养初期：QO2逐渐增高，X较小。在对数生长初期：达到(QO2)m，但此时x较低，r并不高。在对数生长后期：达到rm,此时QO2<(QO2)m

，对数生长期末：S↓，QO2↓,r↓培养后期：S→0，QO2↓↓,r↓↓微生物种类微生物本身遗传特征的影响，如k0↑，QO2↓菌龄的影响:一般幼龄菌QO2大，晚龄菌QO2小2.培养液中溶解氧浓度各种微生物对发酵液中溶氧浓度有一个最低要求，即不影响微生物生长繁殖的最低溶氧浓度称为临界氧浓度，以Ccr表示。CL>Ccr，QO2保持恒定QO2＝(QO2)mCL<Ccr，QO2大大下降溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响CCrQO2CLCCr:

临界溶氧浓度,指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。3.培养基的组成碳源种类耗氧速率：油脂或烃类>葡萄糖>蔗糖>乳糖碳源浓度浓度大,QO2↑;浓度小,QO2↓4.培养条件

温度越高，培养基成分愈丰富，呼吸强度越高；

最适pH时，需氧量最大。5.培养液中CO2的积累

CO2溶解度>氧气，含量高影响氧含量，降低呼吸强度。（三）影响发酵过程中供氧的因素搅拌空气流速空气分布器培养基的物理性质发酵罐的温度和压力搅拌（1）搅拌能把通入发酵罐内的空气泡打碎成小气泡，增加空气和发酵液的接触面积，而且小气泡的上升速率比大气泡慢，相应的增长了氧与液体的接触时间；（2）搅拌能减少气泡周围的液膜厚度和菌丝表面液膜的厚度，能增强溶解氧进入细胞的速度；（3）搅拌还可以阻止或减少菌丝结成团块和颗粒，减小菌丝和液体间的扩散阻力，利于溶解氧进人菌体；(4)使发酵罐内的温度和营养物质浓度均匀，有利于氧气和发酵液、菌丝混合，利于微生物吸氧。空气流速在一定范围内，空气流速加大，会提高发酵液的供氧能力。但如搅拌叶“过载”，再提高空气流速时，并不增加发酵液中氧的浓度。所谓的“过载”，就是叶轮不能分散空气，气流形成大气泡在轴周围逸出，使搅拌效率和溶氧速率都大大降低。空气分布器一般来说，小直径的空气鼓泡器的通气效果比大型环状鼓泡器的通气效果要差。为了增加空气鼓泡器的通气效果，一般会增高发酵液的高度，增加空气和发酵液的接触面及接触时间，或装多层多孔筛板，甚至在筛板上装导流管来加大发酵液的大循环，以增加液-气接触，提高发酵液的溶氧浓度。发酵罐的温度和压力温度升高，氧在发酵液中的溶解度降低；而升高温度又会加快微生物的生长、繁殖速度，增加对氧的需求量。所以，升高温度会大大降低发酵液的氧浓度。发酵罐压力的升高，会增大氧在发酵液中的溶解度，从而增强发酵液的供氧能力，但增大罐压，也会大大增加二氧化碳的溶解度，降低发酵液的pH值，影响发酵。故发酵时，罐压不能太高。培养基的物理性质一般培养液的粘度增大，通气效果减弱，其供氧能力降低；发酵液越稠厚，通气效果越差，也会减弱其供氧能力；菌丝浓度的加大将会大大地降低通气效果。(四)溶解氧的控制

1.测定：覆膜氧电极测定法2.溶解氧的控制不同产物所用的产生菌株不同或同一产物所用的产生菌株不同，所需溶氧量不同；即使同一菌株由于发酵工艺不同、所处的阶段（生长阶段和产物合成阶段）不同，其所需的溶解氧量也不同。（1）调节通气量

生产上关于通气量的大小有两种描述：一种是直接以空气流量大小来表示，单位一般为m3/h；另一种以通气强度大小（也叫通气比）来表示，即每分钟单位体积发酵液通入的空气体积，单位一般为m3/（m3·min）。测量通气量最简便的方法是转子流量计。它是—种结构简单、直观、压力损失小、维修方便的仪器。转子流量计通常直接安装在发酵罐的排气管道上。空气流量调节可以通过调节发酵罐的进气阀门以及排气阀门的开度来实现，从而满足微生物在不同发酵阶段对氧的需求。（2）调节搅拌转速搅拌转速大小与氧在发酵液中的传递速率和发酵液的均匀性有关。搅拌转速与发酵的溶氧系数关系十分密切。

可通过变频器控制电机的转速完成控制搅拌转速的操作。（3）调节罐压发酵容器都装有压力测量装置，最通用的是弹簧压力表。单圈弹簧管压力计是最常用的压力表，一般安装在发酵罐和过滤器的顶部，它所指示的数字是表示高于大气压的压力数。控制压力的方法，一般为调节进口或出口阀门，改变进入或排出的空气或气体量，以维持工艺规程所需的压力。罐压对微生物生长繁殖和产物合成的影响主要表现为压力提高氧的溶解度，改善发酵过程中溶氧的供应。单元二微生物发酵制药技术基础项目六发酵过程控制任务六发酵过程中泡沫的控制（1）通气流量和搅拌的程度

泡沫随通气量和搅拌速度的增加而增加。1.泡沫形成的原因以及规律（一）泡沫的产生及其对发酵的影响（2）培养基的配比及原料组成天然培养基产生的泡沫特别多，而且泡沫持久。人工合成培养基就不容易产生泡沫。发酵培养基中的蛋白质原料，如蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉等是主要的发泡物质，其含量越多，越容易起泡（3）发酵菌的特征发酵菌种不同，产生泡沫的能力也各有差异。发酵菌体生长、繁殖快，培养基产生的泡沫量就少：生长繁殖慢的菌种在发酵时，所产生的泡沫就多，而且时间长久。为了减少泡沫产生对发酵的影响，接种量可以稍大一些，必要时可适当提高罐温。（4）培养基的灭菌温度过高，压力过大，也会引起泡沫的产生。2.泡沫对发酵的危害降低了发酵罐的装料系数影响菌体的生长增加了染菌的机会降低发酵物的产量（二）泡沫的消除1.机械消沫定义：用机械所引起的强烈振动或变化使泡沫破裂而消沫。优点：不需引进外界物质，从而减少染菌机会，节省消泡剂。缺点：不能从根本上消除泡沫成因。（1）化学消泡法机理降低气泡膜面局部表面张力降低气泡膜面局部机械强度降低膜的表面黏度2.化学消沫法（2）发酵工业常用的消泡剂天然油脂：常用的有玉米油、米糠油、豆油、棉籽油、鱼油及猪油等。聚醚类：在生产上应用较多的是聚氧丙烯甘油和聚氧乙烯氧丙烯甘油(又称泡敌)。高级醇类：十八醇是较常用的一种，可以单独或与载体—起使用。聚乙二醇具有消沫效果持久的特点，尤其适用于霉菌发酵。聚硅氧烷类：主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物。（3）化学消泡剂的使用最简单的方法是定时观察发酵罐视孔上泡沫产生情况，发现泡沫持续上升时，开启消泡剂贮罐的阀门，流加少量消泡剂，使泡沫消失即可。泡沫的自控方法，可在罐内顶部装一个不锈钢探头并与控制仪表连结，用以控制消泡阀门的开启。

单元二微生物发酵制药技术基础项目六发酵过程控制任务一发酵过程主要控制参数

物理参数化学参数生物参数发酵过程的主要控制参数1.温度指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。2.压力发酵过程中发酵罐维持的压力。主要目的：罐内维持正压，保证纯培养；罐压的高低与氧、CO2在培养液中的溶解度有关，间接影响菌体代谢。罐压一般维持在表压0.02～0.05MPa(0.2～0.5大气压)。

测定：一个简单的膜式压力表的指示即可。物理参数3、搅拌转速（r/min）是指搅拌器在发酵罐中转动速度，通常以每min的转数来表示。搅拌转速大小与发酵液的均匀性和氧在发酵液中的传递速率有关。发酵罐的搅拌器的转速，依罐的大小而异。小罐的搅拌器转速要比大罐的快些。

发酵罐的容积(L)搅拌转速范围(r/min)31030502005001000050000200～2000200～1200150～1000100～80050～40050～30025～20025～160不同大小的通用型发酵罐搅拌器转速范围

指搅拌时所消耗的功率，指每m3发酵液所消耗的功率（kW/m3）

通用式发酵罐的搅拌功率是选择电动机的依据大小与溶氧传递系数KLa有关搅拌是以下述方式促进氧的传递：搅拌能把大的空气气泡打成微小气泡，增加了接触面积，而且小气泡的上升的速度要比大气泡慢，因此接触时间也增长。4、搅拌功率指每min内每单位体积发酵液通入空气的体积，也叫通风比。需氧发酵中重要的控制参数之一。大小与氧的传递和其它控制参数有关。一般控制在0.5～1.0L/L·min之间通入发酵罐中的无菌空气的流量常用转子流量计测定。流量计中浮动转子的位置可以通过电容或电阻原理转换为电信号，经过放大之后启动控制器便可实现气体流量控制自动化。

5、空气流量(V/V.min)

黏度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况，通常用表观黏度表示。它的大小可影响氧传递的阻力，也可反映相对菌体浓度。发酵液的表观黏度与培养基的成分有关，如含有多糖类物质时，非常粘稠。而且与菌体的浓度也有关系。特别是霉菌和放线菌培养，由于大量的菌丝体，使培养液十分稠厚。

生产上的简便测定方法用一根长