2019国自然基金标书范文,可直接套入研究对象成为标书

2019国自然基金标书范文,可直接套入研究对象成为标书题目：X-Y轴调控糖基转移酶对大肠癌肝转移的作用机制研究摘要：大肠癌的远处转移对患者的预后影响极大，其中肝转移是最常见的一种。本研究通过建立大肠癌远处转移的特征分子谱式，发现真核起始因子Z家族成员X和Y在肝转移中具有关键调节作用。X-Y轴能够介导大肠癌肝转移的发生，X促进细胞获得运动能力，并在转移灶中通过Y的相互作用促进细胞异常增殖。进一步实验证实，X能调节下游糖基转移酶，可能存在激活肠癌细胞膜表面半乳糖残基，从而通过与肝细胞膜上特异性受体相互作用而使肠癌细胞“定居”于肝脏的机制。本项目旨在从大样本回顾性分析中总结X-Y对于结肠癌肝转移的临床相关性和预后判断价值，并在细胞和动物模型中进一步探讨其在结肠癌肝转移调控中的作用方式和调控分子机制，解析下游效应途径及靶点。一、立项依据大肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居恶性肿瘤的第三位。虽然手术、化疗、放疗等治疗手段的提高已经显著提高了患者的生存率，但远处转移仍是影响预后的主要因素。在美国大肠癌中有90%的死亡由肿瘤的远处转移所致。因此，深入研究大肠癌的转移机制，认识大肠癌术后转移模式，制定合理的术后随访方案，采取有针对性的干预措施，提高生存率具有重要意义。本项目旨在探讨X-Y轴调控糖基转移酶对大肠癌肝转移的作用机制，为大肠癌转移的预防和治疗提供理论依据。大肠癌最常见的远处转移部位是肝脏和肺。过去，人们认为大肠癌首先转移到肝脏是因为结肠通过门静脉系统回流进入肝脏。然而，最近的临床研究表明，大肠癌患者术后转移也可能首先出现在肺部甚至是甲状腺转移，这对随访策略提出了挑战。因此，即使术后没有肝转移，也不能放松对肺部的检查。在前期临床研究中，研究者通过对大肠癌患者资料的研究发现，高位直肠癌和直肠中、低位直肠癌的术后肺转移率和肝转移率没有显著性差异。这表明，大肠癌的术后转移模式的因素并非仅仅解剖可以阐释。近年来的研究发现，原发肿瘤的分期、术前放化疗、转移靶器官的微环境等因素都会影响大肠癌的转移模式，但其确切机制仍未探明。为了寻找大肠癌远端转移相关分子靶标并评估其作为预测远端转移发生的潜在分子标志物的可能性，研究者在临床上收集了6例珍贵的同时性肝、肺转移分别切除的患者。通过高通量的基因芯片技术，从全基因表达谱的角度对这两种转移组织的基因表达情况进行了全方位的检测分析。研究结果发现，有41个基因在两种大肠癌远处转移组织中存在显著性差异，这些分子可能构成了驱动大肠癌不同转移模式的分子因素。为进一步确认芯片的结果，研究者在47例大肠癌肝转移和22例肺转移组织病理样本中，通过qPCR的方式进行了回顾性验证，确认了13个在大肠癌肝转移过程中明显高表达的基因（5倍以上），区别于肺转移，这是一种特异性的表达改变。我们的研究关注了两个属于真核起始因子Z家族的成员X和Y，它们是肝转移特异的分子标志。Z真核起始因子在真核生物翻译起始过程中扮演重要角色，但在肿瘤中的角色功能尚不清楚。我们首先鉴定了大肠癌细胞中高表达的Y基因，并证实Y表达被干扰后，细胞增殖能力显著抑制，细胞周期也发生了变化。我们还发现X与Y之间存在相互结合，X对于Y的促恶性增殖功能是必需的。而X本身具有调节细胞迁移的能力，抑制X可显著降低细胞运动性。因此，我们提出科学假设：真核起始因子X-Y轴能够调控大肠癌肝转移的发生，X可介导细胞获得运动能力，并且在转移灶中调节Y发挥促进肿瘤细胞继发性增殖的作用，具体作用机制有待阐明。在哺乳动物中，Z因子的亚基有8种，它们参与真核细胞翻译过程，并在维持细胞生长控制中起重要作用。Z因子不仅能通过促进mRNA与40s亚基结合，而且还可以独自与游离的40s亚基结合，影响40s亚基与60s亚基及其他亚基蛋白的结合或解离等。Z家族成员一般含有PCI和MPN结构域，这两类结构域都参与蛋白-蛋白相互作用，部分还具有RNA识别结构域，可能参与RNA的结合。除此之外，Z因子还被发现具有调控细胞周期的作用。通过调节不同类型的mRNA的翻译起始，Z因子就可以选择性地调控蛋白的合成，从而对肿瘤细胞的生长的转移等生物学行为进行调控。Z家族中的一些成员已证实在肿瘤的发生和发展中扮演重要角色，包括A、B、C、D等。Y的致癌作用已被报道，并在胶质瘤和呼吸系统肿瘤中的作用也被其他研究者发现。然而，关于X与恶性肿瘤的关系目前还未见文献报道。因此，在针对X、Y两个分子尤其是交互作用方面，我们的研究处于领先地位。最近，JBiolChem杂志发表的一篇文章揭示了X蛋白在40S核糖体亚基和包含Y蛋白的复合物结合过程中的关键作用。研究发现，缺失X会导致两者结合不稳定，同时也会降低翻译起始系统的调节能力。此外，另一篇JBiolChem的文章报道了W蛋白可以与X竞争性结合Y，从而形成不同的Z复合物。这些Z复合物可以招募tRNA或mRNA，并调节下游基因表达，从而影响肿瘤细胞的生长和迁移等生物学过程。不同的Z因子蛋白结合可能存在不同的翻译调节机制，从而发挥不同的功能作用。最近的研究表明，X蛋白在肠癌细胞中扮演着重要的调节作用。通过敲减X，基因芯片检测显示多个关键调控节点发生了改变。其中，三种半乳糖基转移酶（β1,3-GalT;β1,4-GalT-1;β1,4-GalT-7）的表达降低，引起了研究人员的兴趣。糖基化是一种常见的蛋白翻译后修饰，参与细胞增殖、分化、转移、侵袭、免疫应答等多种生命活动。糖基化紊乱可以导致多种肿瘤的发生和恶性转化，而糖基转移酶的表达和活性与多种肿瘤的恶性化程度相关。此外，一些研究还发现，半乳糖基转移酶通过调节不同的信号通路，如EGFR和整联蛋白信号通路，影响肝癌细胞的生长和凋亡，以及神经细胞瘤的侵袭能力。激活半乳糖基转移酶可以增加细胞膜上蛋白的糖基化程度。试建立X-Y调节轴与结肠癌肝转移的预后判断模型。2)在大肠癌细胞株和小鼠模型中，通过基因敲除和过表达技术，研究X与半乳糖基转移酶的调节作用机制，探讨X-Y调节轴在结肠癌肝转移过程中的作用方式和调控分子机制。3)通过分子生物学技术，研究X调节半乳糖苷转移酶表达的方式和作用靶点，明确其介导的信号通路，并确认X在Y复合物发挥功能的效应分子途径中的作用。2、研究目标1)探讨X-Y调节轴在结肠癌肝转移过程中的作用机制和调控分子机制，揭示其内在调节机理。2)建立X-Y调节轴与结肠癌肝转移的预后判断模型，为肠癌预后判断提供新的分子标志。3)为相关靶点应用于临床转化医学奠定理论基础。3、拟解决的关键科学问题1)X-Y调节轴在结肠癌肝转移过程中的作用机制和调控分子机制。2)X-Y调节轴与结肠癌肝转移的预后判断模型的建立。3)相关靶点的应用于临床转化医学的理论基础。本研究旨在建立基于X、Y表达的分子预测模型，并评价其在临床上的应用价值。在肠癌细胞株中过表达和沉默X、Y基因，观察细胞功能变化，并在细胞实验的基础上应用裸鼠成瘤和肝转移动物模型进行验证，以探究X、Y对于肠癌恶性增殖和转移发生的影响。同时，结合细胞、动物和组织水平的研究数据，阐明X、Y在肠癌发生、进展中的功能作用。本研究的技术指标是基于Y在肠癌细胞高表达能促进细胞恶性增殖和周期改变，X与Y之间存在相互结合，而X具有调节细胞迁移的能力，证实X-Y轴能够调控大肠癌肝转移的发生，X可介导细胞获得运动能力并在转移灶中调节Y发挥促进肿瘤细胞继发性增殖的作用。在体内、体外明确其促肝转移功能作用基础上，X调控结肠癌细胞迁移的分子机制通过以下两个目标进行深入探讨：1)阐明Y复合物调节的信号通路与效应分子；2)确认X与Y相互结合的序列位点和精细调控；3）探讨X调节大肠癌肝转移模式的具体作用机制。本研究所需解决的关键科学问题是X和Y在大肠癌肝转移中的临床意义。通过大样本组织中检测这两个分子的表达，并利用病理和随访数据进行统计分析，我们可以获得多因素条件下这两个靶标的临床价值。这其中，规范化的组织样本库、随访数据的积累以及统计方法的运用都是重要的影响因素。申请者所在课题组在这方面从事过多个课题的研究，具有丰富经验。另外，这两个靶标的检测有成熟的商业化抗体，方法学上也不存在困难。本研究的第二个关键问题是大肠癌肝转移中X-Y轴的调控分子机制。我们的研究旨在阐明Y介导的迁移功能及糖基转移酶信号途径的效应分子和作用方式，并确认Y与X结合的精细调控及促进肿瘤细胞增殖的分子机制。为了实现这一目标，我们需要进行扎实的前期工作。首先，我们已经通过沉默Y和X基因的功能表型结果发现，Y可调控细胞增殖，而X能够调节细胞迁移，并影响Y对肿瘤的促增殖作用。在此基础上，我们需要深入研究X如何调节细胞迁移功能，其下游调节糖基转移酶是否与肝脏特异性的转移相关，以及它们具体的作用机制是怎样的。我们将逐条验证逻辑清晰的机制通路假设，以揭开X作用通路的神秘面纱。最后，我们将研究Y和X之间的cross-talk，通过阐释X-Y复合物调节的位点和下游与细胞增殖功能相关的机制，形成完成的研究故事。考虑到肿瘤细胞增殖机制方面报道众多，我们可以参考丰富的模式，这方面的研究也不会有太大的科学风险。2.研究方法我们将采用基因芯片鉴定X、Y在肠癌肝转移组织中特异性高表达，以及Y基因RNAi慢病毒感染和X基因RNAi慢病毒感染等方法。我们还将进行裸鼠移植瘤模型和裸鼠肠癌肝转移模型实验，以验证X-Y轴可能调控大肠癌肝转移的发生。我们将使用qPCR、WB验证X对半乳糖基转移酶的调控，并进行EMSA/Co-IP实验验证X-Y的RNA/蛋白相互作用。我们还将对X的序列进行分段，分别构建载体，用Co-IP的方法检测与Y结合的区域，并对目标序列区域进行分析，设计点突变，验证XY结合的位点。此外，我们还将收集500例肠癌组织和肝转移组织样本，进行免疫组化检测X、Y蛋白表达和定位，并根据临床的病理资料/预后和随访资料分析X、Y表达对肠癌预后的临床意义。最后，我们将研究X、Y对肠癌细胞体内成瘤能力的影响。3.可行性分析我们的研究方法和技术路线已经在前期研究中得到了验证，具有很高的可行性。我们将充分利用现有的实验设备和技术平台，同时加强与相关领域的合作和交流，以提高研究的效率和质量。我们相信，通过我们的努力和不断探索，我们将揭示X-Y轴在大肠癌肝转移中的调控分子机制，为肠癌的治疗和预防提供新的思路和方法。验证X-Y轴在肠癌肝转移中的作用，本研究采用多种方法进行探究。2.1X、Y在结肠癌发生、发展中的作用和预后相关性本研究回顾性收集了500例肠癌临床标本，包括手术切除的肠癌组织、匹配的肝脏转移灶手术和穿刺标本，新鲜组织液氮保存标本200例，石蜡块300例。所有病例均通过临床、影像学、病理诊断，术前未进行辅助治疗，来自某某医院2008-2013年临床收治病例，随访资料齐全。采用免疫组化检测组织切片中X、Y蛋白的表达及定位，并设立阴性对照、肿瘤对照、肝转移对照。使用SPSS16.0统计软件对X、Y表达及定位与临床标本进行病理关联性分析和预后统计分析，建立Cox比例风险回归模型，综合探讨临床各因素和X、Y表达与结肠癌肝转移、转移灶形成及预后的相关性。2.2体外、体内水平研究X、Y基因在肠癌肝转移中的调节功能为了研究X、Y基因在肠癌肝转移中的调节功能，我们制备了X-shRNA慢病毒，建立X稳定沉默的细胞株，并以无义序列作为阴性对照。使用MTT实验观察X沉默后细胞的生长曲线，克隆形成实验检测X沉默后细胞的克隆形成能力，流式细胞术结合PI单染、Annexin-V双染检测细胞周期和凋亡情况，细胞划痕实验和Transwell实验观察细胞运动能力的变化。同时，我们还制备了过表达X的慢病毒载体。在稳定沉默X的结肠癌细胞中，导入过表达Y的慢病毒载体，观察X沉默且Y过表达后细胞的增殖能力变化，细胞划痕实验和Transwell实验观察细胞运动能力的变化。同样地，在稳定沉默Y的结肠癌细胞中，导入过表达X的慢病毒载体，观察Y沉默&X过表达后细胞的增殖能力变化，细胞划痕实验和Transwell实验观察细胞运动能力的变化。最后，我们制备了结肠裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤生长情况，建立生长曲线，统计分析Y和X对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响，明确Y和X在结肠癌恶性增殖的作用。实验分组包括空白对照、Y沉默组、X沉默组、X沉默组+Y过表达组、Y沉默组+X过表达组。计合适的引物，制备X和Y的蛋白质，进行电泳迁移实验，观察X和Y蛋白之间的结合情况。8)最后，通过以上实验结果，综合分析X和Y在结肠癌肝转移中的作用机制，明确X-Y轴调节结肠癌肝转移的分子机制，并为结肠癌肝转移的治疗提供新的思路和方法。4)本研究旨在建立结肠癌肝转移动物模型，观察肝脏中的转移灶，统计分析Y和X对结肠癌肝转移能力的影响，并明确它们在结肠癌肝转移过程中的作用。实验分为空白对照组、Y沉默组、X沉默组、X沉默组+Y过表达组和Y沉默组+X过表达组。5)本研究采用qRT-PCR和免疫组化方法检测Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表达，同时使用激光共聚焦显微镜观察X与Y的共定位情况。部分肿瘤组织制备成冰冻切片，利用FITC和TRITC双标记免疫荧光染色进行观察。2.3.本研究旨在研究X-Y轴调节结肠癌肝转移的分子机制。首先，通过基因芯片Microarray分析X过表达/沉默后基因表达谱变化情况，对原始数据进行归一化、标准化，差异表达分析，明确X消减后表达发生改变的下游调控分子，并进行二次表达验证。其次，利用BayesianNetwork、Genes2Networks、Go-anaslysis软件进行signalingnetwork重建，解析X调控结肠癌细胞运动能力的信号通路网络，构建X为核心的信号分子网络。接着，利用信号通路抑制剂处理X稳定过表达/沉默后结肠癌细胞和对照细胞，检测不同分子信号对X表达及功能的作用，验证阻断这些信号通路后对X在结肠癌中的功能表型的影响。采用信号通路高通量检测蛋白芯片，检测X基因表达变化后特定通路关键蛋白的变化。最后，我们分别构建X、Y的真核表达载体，共转293T，通过免疫共沉淀（Co-IP）验证XY的相互结合作用。7)本研究使用EMSA实验验证X与Y之间的相互作用关系，设计合适的引物，制备X和Y的蛋白质，进行电泳迁移实验，观察X和Y蛋白之间的结合情况。8)通过以上实验结果，我们综合分析X和Y在结肠癌肝转移中的作用机制，明确X-Y轴调节结肠癌肝转移的分子机制，并为结肠癌肝转移的治疗提供新的思路和方法。本项目旨在研究X-Y轴在结肠癌肝转移过程中的功能作用以及其对下游RNA的调控机制。为了达成这一目标，我们将进行以下可行性分析。首先，我们已经进行了大量的预实验，证明Y可以调节结肠癌的恶性增殖。因此，本项目具有较好的可行性。其次，我们的课题组成员长期从事结直肠癌的诊治和发生发展机制研究，积累了大量的经验，包括免疫组化、免疫印迹、实时荧光定量PCR、RNA干扰、慢病毒包装、表达谱芯片研究等方面。我们所需的主要仪器设备也已经具备。此外，我们的团队成员年轻优秀、配备合理，每个人都有自己的研究专长，能够保障本实验的顺利完成。我们还可以利用仁济医院普外科的大量结直肠癌手术标