药品微生物验证实例课件

微生物限度检查法

验证实验要点及实例微生物限度检查法

验证实验要点及实例1标准化操作方法选择样品处理冲洗方法和条件中和剂加入菌液加入标准化操作2标准化操作冲洗方法

强调少量多次：50ml/次；强调充分振摇；操作细节的标准规范，如集菌仪转速、冲洗过程中盖还是不盖滤筒下口等等。

标准化操作冲洗方法3标准化操作中和剂加入

不同中和剂加入方式可能效果不一样。通过我们的经验，基本倾向于直接加入培养基中效果最好。但如果某些中和剂对微生物生长不利可考虑其他步骤加入。标准化操作中和剂加入4标准化操作菌液加入按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑滤器的有效性。滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查（如检查阳性菌液通过滤筒的流出液）。标准化操作菌液加入5标准化操作菌液加入

而验证实验主要考虑滤膜/滤器残留抗菌物质对阳性菌生长的影响，可以与对照滤筒比较而做出判断，所以验证实验中加菌时机与方式只要与对照一致即可。标准化操作菌液加入6验证实验的几个问题微生物限度检查法验证实验要点验证实验实例验证实验的几个问题7微生物限度检查法验证实验要点样品菌种和实验用菌液（同无菌检查）回收率测定实验控制菌检查的验证实验器材微生物限度检查法验证实验要点样品8首先应是合格的样品。微生物限度检查样品首先应是合格的样品。微生物限度检查样品9微生物限度检查样品样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证

一般口服制剂验证大肠埃希菌

外用制剂验证金葡和铜绿假单胞含药材原粉；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂的大肠菌群检查验证含动物组织（包括提取物）口服制剂验证沙门菌阴道给药制剂（中成药）验证梭菌微生物限度检查样品样品给药途径和类型决定何种控制菌检查验证10抽样量和检验量分别单列一项。抽样量一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装）的3倍。检验量指供试品一次检验的用量。一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其检验量改为10g或10ml。验证实验按检验量执行。

微生物限度检查样品抽样量和检验量分别单列一项。微生物限度检查样品11微生物限度检查样品制剂形式多样，决定前处理各异

难溶固体制剂非水溶性制剂软膏、油膏栓剂等微生物限度检查样品制剂形式多样，决定前处理各异12供试液的制备制备供试液所用的乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。

7类供试品供试液的制备，其中增订：微生物限度检查样品前处理供试液的制备制备供试液所用的乳化剂、分散剂、中和剂及其用13非水溶性供试品

①司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80

②供试品10g，20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充分振摇，使供试品溶解。然后加

45℃100mlpH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇5-10分钟，萃取，待油水分层后，取水层作为1：10供试液。微生物限度检查样品前处理非水溶性供试品微生物限度检查样品前处理14

非水溶性膜剂供试品

化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。一部中药膜剂取50cm2，剪碎，加适量的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（50或100ml）浸泡，振摇，以供试品浸液为供试液。（SOP2000版规定:中药膜剂取30-50cm2，剪碎，加水100ml）。微生物限度检查样品前处理非水溶性膜剂供试品微生物限度检查样品前处理15肠溶及结肠溶制剂供试品10g，加100mlpH6.8无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠制剂）,于45℃水浴振摇，使溶解。

微生物限度检查样品前处理肠溶及结肠溶制剂微生物限度检查样品前处理16气雾剂、喷雾剂供试品

取规定量供试品，置冷冻室冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温，并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液），使匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。微生物限度检查样品前处理气雾剂、喷雾剂供试品微生物限度检查样品前处理17具抑菌活性的供试品供试品接种至较大量的培养基中。1ml供试液可等量分注多个平皿；控制菌检查，可加大增菌培养基的用量，或采用薄膜过滤法。

离心集菌法

薄膜过滤法

微生物限度检查样品前处理具抑菌活性的供试品微生物限度检查样品前处理18微生物限度检查样品前处理目标是使不便于取样的供试品分散均匀！微生物限度检查样品前处理19微生物限度检查法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证

定量——回收率测定实验控制菌检查方法验证定性——能否生长、专属性实验微生物限度检查法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证20

在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。

回收率测定实验在建立供试品的细菌、霉菌和酵母菌计数方法或原法的检验条件21验证用菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念株菌、黑曲霉。菌液制备（同无菌检查法）。取培养物用无菌氯化钠溶液稀释成1ml含50～100cfu的菌液。回收率测定实验验证用菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念株22验证方法

试验组取规定量最低稀释级的供试液，加入50～100cfu的菌液，按平板菌落计数方法测定其菌数或薄膜过滤计数。菌液组测定加入的试验菌液的菌数。供试品对照组测定供试品稀释液（本底）的菌数。稀释剂对照组取稀释液加入50～100cfu的菌液，按供试品组供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次

试验菌的回收率。

回收率测定实验验证方法回收率测定实验23

回收率计算

试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数–供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%稀释剂对照组的菌回收率=[（稀释剂对照组的平均

菌落数/菌液组的平均菌落数）]×100%

回收率测定实验回收率计算回收率测定实验24结果判断

稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次平行试验中供试品组的菌回收率均小于70%，不符合验证试验，应建立新的检验方法，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同

时进行。回收率测定实验结果判断回收率测定实验25回收率测定实验常规法（平皿法）薄膜过滤法回收率测定实验常规法（平皿法）26回收率测定实验常规法（平皿法）

在采用培养基稀释法时，应注意避

免在注皿前菌液和供试液直接接触；回收率测定实验常规法（平皿法）27回收率测定实验常规法（平皿法）

稀释法（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均应加1ml菌液。培养基稀释的表示：1:200；1:400；1:1000回收率测定实验常规法（平皿法）28回收率测定实验薄膜过滤法

菌液检验（计数）应与供试液同法处理，也要采用薄膜过滤法。回收率测定实验薄膜过滤法29

在建立供试品的控制菌检查法或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，应对检查法的可靠性进行验证。验证时做规定菌的回收试验，以判断供试品是否具有抗菌活性的实验方法。控制菌检查方法验证在建立供试品的控制菌检查法或原法的检验条件有改变可能30验证用菌株：

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。菌液制备（同前）：

用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10-100cfu。

控制菌检查方法验证验证用菌株：控制菌检查方法验证31验证方法①试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接入增菌培养基中。②阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜

绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照

菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。控制菌检查方法验证验证方法控制菌检查方法验证32结果判定

阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消

除供试品的抑菌活性，并重新验证。

验证试验可与供试品的控制菌检查同

时进行。控制菌检查方法验证结果判定控制菌检查方法验证33控制菌检查方法验证培养基稀释法薄膜过滤法大肠菌群的半定量控制菌检查方法验证培养基稀释法34实验器材微生物限度检查薄膜过滤器

经过无数次实验，开发出了成熟的微生物限度检查用薄膜滤器。安全、可靠、方便。采用75mm滤膜，菌落计数更清晰。无需转膜，直接用于控制菌检查。实验器材微生物限度检查薄膜过滤器3575mm薄膜过滤器75mm薄膜过滤器3675mm薄膜过滤器75mm薄膜过滤器37验证实验的几个问题微生物限度检查法验证实验要点验证实验实例验证实验的几个问题38验证实验实例洁身泡沫剂 供试液制备：取供试品，放置在-40℃低温冰柜中冷冻1-2小时，瓶内液体凝固取出，在无菌条件下迅速开启，将内容物取出放入无菌的三角烧瓶内，等内容物完全液化后，取供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨

缓冲液至100ml，制成1:10的供试液。验证实验实例洁身泡沫剂39验证实验实例氧氟沙星凝胶 供试液制备：取供试品10g，加无菌的5％氯化钙溶液10ml充分混合均匀，再加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液备用。验证实验实例氧氟沙星凝胶 40验证实验实例 复方醋酸地塞米松乳膏

供试液制备：取供试品10g，加45℃的无菌0.1％吐温溶液至100ml，混匀，作为供试液。验证实验实例 复方醋酸地塞米松乳膏41验证实验实例双唑泰软胶囊栓称取样品10g，加PH7.0氯化钠-蛋白胨-聚山梨酯80的混和液100ml(水温为40℃)至100ml，浓度为1：10供试液。验证实验实例双唑泰软胶囊栓42验证实验实例离心集菌薄膜过滤法取离心管上清液1ml加入薄膜过滤器中,冲洗300ml/膜,另取1ml上述5种试验菌株，加入平皿中，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌加营养琼脂培养基20ml，白色念珠菌和黑曲霉菌玫瑰红钠琼脂20ml,待凝固后，再取膜贴于琼脂平板,置规定温度培养

24~72小时观察结果，细菌计数，测

定回收率。验证实验实例离心集菌薄膜过滤法43验证实验实例黄连上清片取供试品10g，置均质器中充分混匀后加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液。验证实验实例黄连上清片44验证实验实例

富马酸酮替酚滴鼻液

控制菌需检查大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌

验证实验实例

富马酸酮替酚滴鼻液

控制菌需检查大肠埃45验证实验实例西洛他唑缓释片按药典规定供试液应为1：10但此缓释片配成1：10供试液时，其粘稠度过大，不利于吸取供试液，所以将此类药物配制成1：20供试液。验证实验实例西洛他唑缓释片46验证实验实例调补肺肾胶囊

此药品中含有动物组织控制菌需做沙门菌的检查在验证试验中我们发现此药品抑制沙门菌，用稀释法10g加入到1000ml营养肉汤中，阳性菌才生长。验证实验实例调补肺肾胶囊47验证实验实例

玉屏风软胶囊此药品软胶囊中的液体含有一定的油脂，配制1：10的供试液时油脂浮在水面上，不利于取样，所以在配制供试液时，用45℃的无菌0.1%聚酸梨酯80溶液。

验证实验实例

玉屏风软胶囊此药品软胶囊中的液体含有一定的48验证实验实例供试品→供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)

↓80℃10min∣迅速冷却|

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100ml0.1%疱肉培养基