实验报告血红蛋白

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实验报告

课程名称：生化实验B实验日期：

班级：姓名学号：

血红蛋白凝胶过滤

一、背景及目的

血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。

凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的(本文来自：小草范文网:实验报告血红蛋白)颗粒大小、均匀度

2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH

6.而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。

影响凝胶过滤的因素主要有：

1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。

2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。

3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。

4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。

目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：

1、脱盐2、用于分离提纯3、测定高分子物质的分子量4、高分子溶液的浓缩5、蛋白质的复性

二、实验原理

层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。按操作形式可以划分为：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。2

凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。

本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形1

21百度百科凝胶过滤层析/81744.htm百度百科层析/15375.htm#2

象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。

本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼就可以检验分离效果。

三、仪器与试剂、实验材料

1、仪器

⑴层析柱⑵恒流泵（HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂）⑶胶头滴管

⑷50ml烧杯3个⑸玻璃棒

2、试剂

⑴磷酸缓冲液（老师已配好）

⑵还原层试剂（1:1的40nMFeSO4和80mMNa2H2EDTA,0.2MNaHPO4,,老师提供）

⑶SephadexG-25

3、实验材料

血红蛋白样品（1ml抗凝血加10mlpH7的20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，浓度达5mg/ml，老师提供）

四、实验步骤

1、凝胶溶胀：老师已准备好

2、检验：旋上层析柱下端柱帽，加少量去离子水，看水是否顺利流出，如果流速过缓，用洗耳球自上端吹气，使其畅通。上下端倒置，按上述步骤检验。

3、装柱及平衡：取下上端柱帽，装入5cm左右的洗脱液，溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱，使柱中的凝胶一直处在溶液中，装柱长15cm左右。溶液液面应该高于凝胶面3-5cm，防止凝胶因脱水而毁柱。实验中沉降完成后，液面高于凝胶面4cm左右。此时观察柱面，上下均一，无界面，裂隙。旋上上端柱帽，细管管接上磷酸盐缓冲液，下端柱帽的细管接恒流泵，开始平衡洗脱。过程中调节好流速，6滴/分。平衡过程20分钟。

4、上样：事先剪好略小于层析柱内径的滤纸片，打开上柱帽，将滤纸片放入层析柱中，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，防止上样时液滴对床面的冲击。确定流速后准备上样。利用恒流泵排气键加速洗脱，直至洗脱液面与胶床液面相切，停止洗脱。用滴管加0.7ml还原试剂，小心注入胶床液面中央。开始洗脱，待液面与凝胶床面相齐时，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上0.7ml血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。

5、待黄色液体全部流出，开排气键，加速洗脱10分钟

五、结果

1、实验现象

还原层上样时，溶液呈黄色，当还原液面与凝胶床面相切时，床面以下两厘米左右呈现黄色。

加上褐色的血红蛋白样品时，开启泵。此时褐色下渗，在未加入缓冲液之前，褐色带下端已经开始变为暗红色。层析柱上的色带由上至下依次为黄色，褐色，暗红色。

当上5ml缓冲液并开始洗脱时候，褐色全部变为暗红色，红色带下端颜色变浅。此时即为两个色带，上端黄色下端暗红。

开始洗脱七分钟时，暗红带下端开始变鲜红色，随时间推移，暗红带全部转变为鲜红色。

过程中，红色带在下，黄色带在上。两色带一直下移。色带边界不是很清晰，而且与其他组的同学相比，鲜红色较浅。

随色带的下移，两色带间距变大。

当开始流出红色液体时，用小烧杯接收，待红色全部流出用了30分钟。

当开始有黄色液滴流出时，用小烧杯接收，黄色液体全部流出用了7分钟。

2、现象解释

血红蛋白样品中的铁离子最初为三价，显褐色。当经过还原带时，三价铁被还原成二价，生成暗红色的还原型血红蛋白。还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧气结合生成鲜红色的氧合血红蛋白。

血红蛋白分子量很大，分子直径大，不能进入凝胶孔穴内部，只能在凝胶颗粒间移动，所以洗脱速度较快。而铁氰化钾分子量小，分子直径小，能够进入凝胶颗粒孔穴内部，故洗脱速度较慢。

3、凝胶过滤效果

相比于其他组的实验现象，我们组的效果不是太好。刚开始的时候，两个色带分离效果不好，没有形成比较清晰的界限，但在最后终于是分开了，而且随着时间的推移，两色带间距拉大。理论上讲，两色带的间距应该保持不变，间距变大的原因，可能是胶床面上的滤纸片没有放平，而且床柱的内部有裂隙，在外部无法观察到。

最后变成的鲜红色带相对颜色较浅，分析原因，是因为在加血红蛋白样品时没有震动试管，而血红蛋白分子又容易沉降，导致加入的血红蛋白样品较少。

六、思考题

总结分析柱层析技术操作的关键步骤和操作要领和技巧。

1、装柱。如果装柱不均匀（没有填严实），使得柱子出现太多气泡，导致分离效果不好。湿法装柱比干

法装柱效果要好。

这就要求在湿装时，要边搅拌边加入填柱料（硅胶或凝胶）。而干法装柱时则要注意密实程度。填完后应该从侧面敲打，使床柱更密实。

要求柱面上下均一，无界面，裂隙。

装柱后加滤纸片的时候应使其自然飘落在凝胶液面上。

2、恒流泵流速。根据实验要求的不同要选择不同的流速。像本次试验要求流速6滴/分，如果过快的话，

分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。如果过慢，则耗

时太长。

3、上样。上样的时候每次加样之前一定要停止洗脱。否则很可能造成液面到达胶面以下而毁柱。另外加

样的时候要用滴管把液体送到接近滤纸的地方再轻轻滴加，防止液体冲击对胶面造成影响。

七、参考文献

1、百度百科凝胶过滤层析

2、百度百科层析/15375.htm#2

3、赵武玲主编，《基础生物化学》，中国农业大学出版社，XX年9月第一版

4、有参考胡老师课件

八、实验小结

这次实验差点就失败了，应该是装柱的时候出了点问题，而在取血红蛋白样品的时候也没有提前摇匀。实验前应该多考虑，多思考，并在实验中注意团队合作。

老师在实验前讲了好多道理，给了我们很大的启发。我喜欢这样不单单教授理论知识的老师。

在实验之前老师提出了一个问题，血红蛋白中的亚铁离子为什么不会被氧气氧化。查了好多资料，可惜看不太懂，无法理解，还是自己的基础知识没有学充分啊。

篇二：血红蛋白测定

血红蛋白测定

【实验目的】

掌握血红蛋白测定的临床意义

熟悉毛细管采血过程，分光光度计的操作

了解血红蛋白测定的注意事项

【实验原理】

血液在血红蛋白转化液中表面活性剂的作用下溶血后，血红蛋白（除SHb外）被高铁氰

-化钾（K3Fe（CN）6）氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi再与氰化钾（KCN）中的氰离子（CN）

结合生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白（HiCN）。HiCN最大吸收波峰在540nm,最小吸收谷为504nm。可用分光光度计直接测定或用HiCN标准液比色法测定。即可求出待测血红蛋白浓度。此法称HiCN法。

【试剂】

血红蛋白转化液（文齐氏液，Vankampen-Zijlstra’液）：

-氰化钾50mg，提供氰离子（CN）

高铁氰化钾200mg，氧化剂

无水磷酸二氢钾140mg，缓冲液成分，维持溶液的pH值，

【实验操作】

（1）取一支试管加入5.0mlHiCN试剂，取全血20μl，加入到5.0mlHiCN试剂中，混匀后静置5min，使血红蛋白转化完全。

0（2）分光光度计，波长540nm，比色杯光径1.0cm，杯温20-30C，以蒸馏水或空白

转化液调零，测定样品吸光度值（A）。

【计算】

根据比尔定律，浓度与吸光度成正比，所以实际操作中我们还可以直接用待测液的吸光度A测/标准液的吸光度A标＝待测液的浓度C测/标准液的浓度C标来直接计算待测液的浓度。

【参考值】

男性：120~160g／L，女性：110~150g／L，新生儿：170~200g／L。

【临床意义】

照书上写

图1红细胞和血红蛋白的生理变化曲线

红细胞计数医学决定水平：高于6.8×1012/L，应采取相应治疗措施；低于3.5×1012/L可诊断贫血；低于1.5×1012/L应考虑输血。

篇三：诊断学实验报告

实验诊断学实验报告

红细胞计数试验

实验目的：通过红细胞计数实验

1、掌握红细胞计数方原理、方法及注意事项。

2、掌握血细胞计数板的结构试验器材：血细胞计数板、显微镜、盖玻片、试管、血红蛋白吸管、生理盐水实验原理：一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后，充入血细胞计数池中显微镜下计数一定容积内的细胞，再换算成每升标本的细胞数报告。操作步骤：1、取红细胞稀

释液2.0ml毫升，放入一小试管内。

2、用血红蛋白吸管吸血至l0ul处。

3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内，上清液嗽洗吸

管2-3次，立即摇匀。

4、将计数池与盖玻片用软布料擦净，将盖玻片覆盖于计数池上。

5、用吸管吸取混匀的红细胞悬液，充入计数池中。

6、待2—3分钟，让红细胞完全下沉后，将计数板平放在显微镜台上，用低倍镜观察，

如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。红细胞计数的区域：中心大方格中的5个中方格(正中一个和四角各一个)。计数原则：

数上不数下，数左不数右的计数原则即凡压在中方格边线(双线)上的红细胞，只计上侧与左

侧线上的细胞，而压在下侧与右侧线上者不计入。计算：红细胞数/l=5个中方格内红细胞数×5×10×201×106或

红细胞数/l=5个中方格内红细胞数÷100×1012式中×55个中方格换算成1个大方格×101个大方格容积为0.1ul，换算成1.0ul。×201血液的稀释倍数×106由u1换算成l

数据处理：rbc:×l0/l

12参考值男:(4～5.5)×10/l12女：（3.5～5）×10/l

12新生儿：（6～7）×10/l12答案不唯一，言之有理即可注意事项：1、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有

血

凝块应重新采血。

2充液前，红细胞复液要充分摇匀，红细胞悬液注入计数池内要求分布均匀，不可有气

泡，亦不可有多余液体外溢。

3、中方格内红细胞分布应均匀，健康成人每中方格红细胞数约为80—100个，各中方

格内之红细胞相近，如悬殊过大(超过10个细胞以上的)应重混匀再充填。实验诊断学实验

报告

血红蛋白测定

实验目的：通过血红蛋白测定

1、氰化高铁血红蛋白比色法原理及技术。

2、掌握红血红蛋白测定的原理、方法及注意事项。试验仪器：试管、微量吸管、分光光度计实验原理：血红蛋白中的亚铁离子（fe2+）被高铁氰化钾氧化成高离子（fe3+），血红

蛋白转化成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白与氰离子（cn-）结合，生成稳定的氰化高铁血红

蛋白。用光电比色计在540nm波长比色。从hicn参考液制作的标准曲线上读取血红蛋白克数。操作步骤：1、取试剂5毫升加入血液20ul混匀置5分钟

2、用721光电比色仪，540nm波长，试剂为空白调0点比色，读取光密度，查标准曲

线得结果。

计算：血红蛋白（g/l）=测定管吸光度×367.7数据处理：答案不唯一，言之有理即可hb：g／l参考值男0.40～0.54l/l女:0.37～0.48l/l

儿童：0.35～0.49l/l新生儿：0.50～0.60l/l注意事项：1、做血红蛋白测定，白细胞计数和分类计数，在采血时应先做血膜再做红

细胞，然后做白细胞，血红蛋白检验，避免红细胞破坏。篇二：实验诊断学实验报告(牡丹江

医学院)

实验诊断学试验操作报告目录

一、红细胞计数试验

二、血红蛋白测定

三、白细胞计数

四、白细胞分类计数

五、尿比重

六、尿沉渣定性检查

七、尿蛋白检查磺基水杨酸法

八、尿干化学分析

九、尿葡萄糖定性检查（班氏法）

十、abo血型测定红细胞计数试验

实验目的：通过红细胞计数实验

1、掌握红细胞计数方原理、方法及注意事项。

2、掌握血细胞计数板的结构试验器材：血细胞计数板、显微镜、盖玻片、试管、血红蛋白吸管、生理盐水

实验原理：一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后，充入血细胞计数池中显微镜

下

计数一定容积内的细胞，再换算成每升标本的细胞数报告。操作步骤：1、取红细胞稀释液2.0ml毫升，放入一小试管内。

2、用血红蛋白吸管吸血至l0ul处。

3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内，上清液嗽洗吸

管2-3次，立即摇匀。

4、将计数池与盖玻片用软布料擦净，将盖玻片覆盖于计数池上。

5、用吸管吸取混匀的红细胞悬液，充入计数池中。

6、待2—3分钟，让红细胞完全下沉后，将计数板平放在显微镜台上，用低倍镜观察，

如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。

红细胞计数的区域：中心大方格中的5个中方格(正中一个和四角各一个)。计数原则：数上不数下，数左不数右的计数原则即凡压在中方格边线(双线)上的红

细胞，只计上侧与左侧线上的细胞，而压在下侧与右侧线上者不计入。计算：红细胞数/l=5个中方格内红细胞数×5×10×201×106或

红细胞数/l=5个中方格内红细胞数÷100×1012式中×55个中方格换算成1个大方格×101个大方格容积为0.1ul，换算成1.0ul。×201血液的稀释倍数×106由u1换算成l

数据处理：rbc:×l0/l12参考值男:(4～5.5)×10/l12女：（3.5～5）×10/l12新生儿：（6～7）×10/l12答案不唯一，言之有理即可注意事项：1、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有

血

凝块应重新采血。

2充液前，红细胞复液要充分摇匀，红细胞悬液注入计数池内要求分布均匀，不可有气泡，亦不可有多余液体外溢。

3、中方格内红细胞分布应均匀，健康成人每中方格红细胞数约为80—100个，各中方格内之红细胞相近，如悬殊过大(超过10个细胞以上的)应重混匀再充填。血红蛋白测定

实验目的：通过血红蛋白测定

1、氰化高铁血红蛋白比色法原理及技术。

2、掌握红血红蛋白测定的原理、方法及注意事项。试验仪器：试管、微量吸管、分光光度计实验原理：血红蛋白中的亚铁离子（fe2+）被高铁氰化钾氧化成高离子（fe3+），血

红蛋

白转化成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白与氰离子（cn-）结合，生成稳定的氰化高铁血红

蛋白。用光电比色计在540nm波长比色。从hicn参考液制作的标准曲线上读取血红蛋白克数。操作步骤：1、取试剂5毫升加入血液20ul混匀置5分钟

2、用721光电比色仪，540nm波长，试剂为空白调0点比色，读取光密度，查标准曲线得结果。计算：血红蛋白（g/l）=测定管吸光度×367.7数据处理：答案不唯一，言之有理即可hb：g／l参考值男0.40～0.54l/l女:0.37～0.48l/l

儿童：0.35～0.49l/l

新生儿：0.50～0.60l/l注意事项：1、做血红蛋白测定，白细胞计数和分类计数，在采血时应先做血膜再做红

细胞，然后做白细胞，血红蛋白检验，避免红细胞破坏。白细胞计数

实验目的：掌握白细胞计数显微镜计数法原理及技术。

实验器材：显微镜、微量吸管、计数板、盖玻片、白细胞稀释液。实验原理：用稀醋酸液将血液稀释并破坏红细胞，混匀后充入计数池中，于显微镜下

计

数一定体积内的白细胞数，经过换算求得每升血液内的白细胞数。操作步骤：1、取试管1支，加白细胞稀释液0.38ml。

2、用清洁干燥的微量吸管准确吸取末梢血20微升或抗凝血20微升。

3、擦去管尖外部余血、轻轻注入稀释液底部，再吸取上清液清洗3次，摇匀。

4、将计数板与盖玻片用软布擦净，将盖玻片覆盖于计数池上，再用微量吸管吸取悬液，充入计数池与盖玻片间的细缝隙中，静止2-3分钟，待白细胞下

沉。

5、用低倍镜计数四角的四个大方格内的白细胞数。计算：(四个大方格内wbc数/4)×10×20×106=wbc数/20×109/升数据处理：答案不唯一，言之有理即可正常参考值：

成人：（4-10）×109/升新生儿：（15-20）×109/升

6月-2岁：（11-12）×109/升白细胞分类计数

实验目的：掌握白细胞分类计数、原理及技术。实验器材：显微镜、染色缸和架，载玻片、瑞氏染液、香柏油、二甲苯。实验原理：把血液制成细胞分布均匀的薄膜涂片，经wright染色后，显微镜下观察，

根

据白细胞形态特点逐个分类计数。得出各种白细胞的相对比值，并注意观察其形态和质

量的变化。

操作步骤：1、取末梢血1滴。置于载玻片的一端，以边缘平滑的推片制成血涂片，空气干燥。

2、用蜡笔在血膜两端划线，以防染液溢出，然后将血片放于染色架上。

3、先加瑞氏染液数滴，使其覆盖整个血膜，固定染色细胞0.5-1分钟。

4、按1：1或1：2加缓冲液与染料混匀，染色10分钟左右。

5、在血膜染10分钟后，用缓冲液或接近中性的水冲去洗液，待自然干燥或滤纸吸干后，用镜油观察。计算：1、先用低倍镜观察血片染色情况，白细胞多少和细胞分布情况。

2、选择血涂片的体尾交界处，染色良好的区域，在油镜下计数100-200个白细胞，按其形态特征进行分类计数，求出各自白细胞所占数值（百分率）。

3、白细胞分类计数方法很多，常用的有，完全记录法、半记录法、分类计数器计数法。

4、每个病人应分类白细胞数，视白细胞总数多少而定。

5、各类细胞所占的百分率乘以白细胞总数/升，既得每升血液中各类白细胞的度。数据处理：

答案不唯一，言之有理即可篇三：诊断学实验总结(官方版)实验诊断学总结

第一章总论

概念

[1]临床检验：以离体的血液、体液、排泄物等为标本，通过试剂、仪器等进行检测，

并对检测的过

程进行全面的质量控制，最终得到可靠的检测结果或数据。

[2]实验诊断：通过临床检验得到的信息为预防、诊断、治疗和预后评价所作的临床医

学活动。

[3]床边检验：在病人医疗现