蛋白质工程复习题

蛋白质工程复习题名词解释构造域：生物大分子中具有特异构造和独立功能的区域，特别指蛋白质中这样的区域基因突变：基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象融合蛋白：将两个或多个开放阅读框按肯定序列挨次连接，融合阅读框表达出一杂合蛋白。蛋白的表达模式:蛋白质的分子设计：构型：的分子构型为L-型和D-型，这种异构体在化学上可以分别。构象：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。构象转变,无共价键的断裂和重形成，化学上难于区分和分别α-氨基酸：原核表达：是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达蛋白质的二级构造构成一种特征的多肽链线性组合。构造域：2个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为构造域。蛋白质的三级构造：构造域在三维空间中以专一的方式组合排布,专一排布。蛋白质分子的四级构造指蛋白质分子的亚基构造subuni方式和亚基间相互作用的性质，构成四级构造的根本内容。亚基：为亚基。其聚合整体称为寡聚体蛋白质的分子设计：从蛋白质分子水平上通过数据库等大量试验数据，结合现代的理论方法通过计算机设计的分子。分子伴侣组份启动子：由核苷酸组成，本身并不掌握基因活动而是通过与转录因子的这种蛋白质结合而掌握基因活动的增加子：能强化转录起始的一段DNA序列为增加子或强化子乳糖操纵子：是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。双特异性抗体：2种抗原的抗体。11种为对应效应成分蛋白质工程：以蛋白质分子的构造与功能的关系为根底，通过有掌握的修饰和合成，对现有符合人类社会需要的型蛋白质。抗体酶：一类具有催化力量的免疫球蛋白。简答题一．简述蛋白质工程争论的根本途径。蛋白质构造分析〔争论核心〕1〕收集大量的蛋白质分子构造的信息；2〕建立构造与功能之间关系的数据；3〕蛋白质构造与功能之间关系的理论争论。主要技术：晶体学技术〔x射线晶体构造分析、多维核磁共振波谱技术构造推测对自然蛋白质构造与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以推测肯定氨基酸序列肽链空间构造和生物功能；依据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间构造。主要技术：分子动力学、分子热力学等，依据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等根本原则分析计算蛋白质分子的立体构造和生物功能。制造和改造蛋白质，转变外表电荷分布促进蛋白质形成肯定的立体构像等等生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等基因重组技术或人工合成DNA：可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全的蛋白质。二．欲使目的蛋白在大肠杆菌中表达，则表达载体的一般特点是什么？1〕复制起始点2〕选择性基因3〕强的、可诱导的启动子4〕强的转录终止序列5〕核糖体结合位点6〕适宜的多克隆位点三．简述X射线晶体衍射技术测定蛋白质晶体构造的具体步骤。培育大的、质量好的晶体；进展初步的x射线衍射分析；重原子衍生物的制备；衍射数据四．列举两种常见蛋白质晶体构造测定方法及争论其优缺点。晶体构造：X－射线优点：能快速、精细、直观地表达出分子内各基团的相互空间关系缺点：不是全部的生物大分子都能够获得良好的结晶；所得到的晶体往往是分子处于基态,而分子功能的行使多发生在激发态，很难捕获到分子的功能状态溶液构造：核磁共振〔NMR〕优点X-X-接近生理状态缺点50KD有时各谱线很难区分。五．简述蛋白质在生物体内的形成的过程蛋白质在体内的形成分为两个阶段：第一阶段：〔氨基酸序列〕的多肽链，称为多肽链的生物合成。其次阶段：功能的蛋白质分子，称为生肽链折叠〔或蛋白质折叠〕六．蛋白质分子设计的步骤是什么？建立所争论蛋白质的构造模型找出对所要求的性质有重要影响位置悬着一系列的在2〕中所选出的位点上转变残基所得到的突变体，一方面使蛋白质可能具有所要求的性质，另一方面又尽量维持原有构造，使其不做大的变动4〕推测突变体的构造5〕定性或定量计算优化所得到的突变体构造是否具有所要求的性质。七．简述目的蛋白原核表达的根本步骤。、制备表达载体：酶切,去磷酸化；胶回收纯化、制备目的DNA：质粒纯化/PCR；酶切；胶回收纯化、将目的DNA克隆到载体上：目的片断与载体连接、转化非表达型宿主菌、筛选阳性克隆:菌落PCR,质粒提取酶,测序确定阅读框、转化表达宿主菌：转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株蛋白溶解性和活性、SDS-,Western印迹等确定目的蛋白、纯化目的蛋白：放大培育、制备粗提物、亲和纯化、切除融合标签并去除蛋白酶八．蛋白质分子设计的步骤是什么？建立所争论蛋白质的构造模型；2.找出对所要求的性质有重要影响的位置；3.选择一系列的在〔2〕中所选出位点上转变残基所得到的突变体；4.推测突变体的构造；5.定性或定量计算优化所得到的突变体构造是否具有所要求的性质。九．简述大肠杆菌中表达体系的优缺点?大肠杆菌中表达体系的优点:大肠杆菌表达体系是目前应用最广的一个外源基因表达体系，是外源基因表达的首选体系。利用大肠杆菌作为表达体系的优点：遗传学和生理学背景清楚；简洁培育，特别是高密度发酵；外源基因常常可以到达高效表达。大肠杆菌表达体系的缺点:大肠杆菌系统最大的缺乏之处是不能进展典型真核细胞所具有的简单的翻译后修饰杆菌细胞内易形成不溶性的包涵体；而当真核基因在大肠杆菌中表达时，作为起始氨基酸，甲硫氨酸常照旧保存在蛋白质的N末端。最终，由于真核mRNA的构造特性以及密码子使用mRNA能得到足够的产物。酶工程复习资料酶的定向进化：模拟自然进化过程(随机突变+自然选择)，在体外对酶基因进展人工随机突些特性的酶的突变体的技术过程。酶反响器件，以便在酶的催化下，使底物〔原料〕最大限度地转化成产物。它处于酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。超临界流体：指温度和压力超过某物质超临界点的流体盐析：在盐浓度到达肯定界限时，酶的溶解度随盐的浓度上升而降低。必需水：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。离子液体稳定性好酶的定义物催化剂。程。酶的分类：氧化复原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶提高酶产量的措施〔、掌握阻遏物的浓度〔产物阻遏作用、分解代谢物阻遏作用、添加外表活性剂、添加产酶促进剂酶的生产方法：提取分别法、生物合成、化学合成培育基的五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水酶生物合成的模式分为4种类型：同步合成型，连续合成型，中期合成型和滞后合成型酶生物合成模式：同步合成型，中期合成型，连续合成型，滞后合成型离心机的分类及选择低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培育基残渣等固形物的分别。也用于酶的结晶等较大颗粒的分别。高速离心机：用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分别。超速离心机：用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分别纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。易错PCR技术原理的基因消灭碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。优点：简便，随机突变丰富；缺点：正突变率低，突变基因文库大，筛选工作量大；适用于较小基因的定向进化酶固定化概念固定化。固定在载体上并在肯定的空间范围内进展催化反响的酶称为固定化酶。方法：吸附法、包埋法、交联法、热处理法应用：运用于工业化生产、酶传感器、酶电极问答题一．如何提高酶的产量?答：a、添加诱导物：对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。b、掌握阻遏物的浓度：阻遏作用依据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用〔葡萄糖等和其它简洁利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质〕引起的阻遏作用。c、添加外表活性剂：外表活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。d二．细胞裂开的方法及原理。a细胞裂开；b、物理裂开法：温度差裂开法，压力差裂开法，超声波裂开法。原理：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层构造破坏，而使细胞裂开；c、化学裂开法：添加有机溶剂〔甲苯、丙酮、丁醇、氯仿通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞裂开；d、酶促裂开法：自溶法，外加酶制剂法。原理：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层构造受到破坏，而到达细胞裂开三．酶分子修饰的意义、方法。概念程称为酶分子修饰。意义：①提高酶的活力；②增加酶的稳定性；③降低或消退酶的抗原性；④争论和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响。方法能发生转变的修饰方法称为金属离子置换修饰。②大分子结合修饰(共价/非共价)：非共价修饰：使用一些能与酶非共价地相互作用而又能面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。共价修饰：用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的外表，形成一层掩盖层。③侧链基团修饰：承受肯定的方法〔一般为化学法〕使酶蛋白的侧链基团发生转变，从而转变酶分子的特性和功能的修饰方法。主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。⑤氨基酸置换修饰：现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。〔高pH值等〕由于酶分子空间构象的转变而引起酶的特性和功能的变化状况。四．酶的分别纯化有：离心分别，过滤分别，沉淀分别，层析分别，电泳分别，萃取分别，结晶分别等五．酶的纯化过程：粗蛋白质(crudeprotein):沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。局部纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各钟柱层析法。均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。分别纯化路线：细胞裂开，提取，离心分别，过滤与膜分别，沉淀分别，层析分别，电泳分别，浓缩，枯燥结晶。六．离心分别，离心机的分类和选择。离心分别是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分别的技术过程。离心机的分类：a、常速离心机：又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力〔RCF〕在1×104g物的分别。也用于酶的结晶等较大颗粒的分别。b、高速离心机〔1～2.5〕×104r/min，相对离心力到达1×104～1×105g，在酶的分别中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分别。为了防止高速离心过程中,温度上升而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。c、超速离心机：最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力可以高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分别纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。七．酶非水相催化的类型。酶在非水介质中进展的催化作用称为酶的非水相催化。a、有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化是指酶在含有肯定量水的有机溶剂中进展的催化反响产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用的构造和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。b、气相介质中的酶催化化反响。由于气体介质的密度低，集中简洁，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。c、超临界介质中的酶催化流体。d、离子液介质中的酶催化酶在离子液中进展的催化作用。离子液〔ionicliquids〕是由有机阳离子与有机〔无机〕的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。八．简述细胞裂开的方法及其原理。分类 细胞裂开方法 细胞裂开原理机械裂开法机械裂开法捣碎法、研磨法、匀浆法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞裂开。物理裂开法 温度差裂开法、压力差裂开法、化学裂开法化学裂开法使细胞裂开。

胞的外层构造破坏，而使细胞裂开。酶促裂开法 自溶法、外加酶制剂法 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层构造受到破坏，而到达细胞裂开。九．固定化酶与游离酶相比，有哪些优缺点？优点〔1〕易将固定化酶和底物，产物分开产物溶液中没有酶的残留简化了提纯工艺〕可以在较长的时间内连续使用〔3〕反响过程可以严格掌握，有利于工艺自动化〔4〕提高了酶的稳定性〔5〕较能适于多酶反响〔6〕酶的使用效率高、产率高、本钱低〔〕固定化时酶的活力有损失〕比较适应于水溶性底物3〕不适于多酶反响。十．阐述酶工程的应用并分别举例说明。酶工程主要应用在以下几个领域：1、发酵工艺：生产葡萄糖、生产氨基酸、生产核苷酸、生产生物柴油、生产抗生素、生产有机酸、甾体激素等；2、医药领域：①疾病诊断方面应用：依据体液内酶活力的变化诊断疾病、用酶测定体液中等；③药物制造方面的应用：生产青霉素酰化酶、β酪氨酸酶、核苷磷酸化酶等；3、分析检测：酶试纸、酶柱和酶管、酶传感器等的应用都有重大奉献；4、根底理论争论：说明酶反响机制、生物工程中去除细胞壁等方面的应用；5、环境保护领域：环境监测、三废处理、生物脱墨等；6、其他方面：洗涤剂工业、酿酒工业、乳制品工业、饼干、纺织工业、化装品等工业中都有应用。十一．写出四种分别纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。凝胶过滤：被分别物质的分子大小不同来进展分别。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状构造物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，中的物质就按不同分子量筛分开了。等电点沉淀：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)