分光光度计基本原理与结构分析课件

分光光度计基本原理、结构、应用介绍

吴伟华1分光光度计基本原理、结构、应用介绍吴伟华1许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。基于比较颜色深浅对溶液进行定量分析的方法称为比色分析法。22溶液为什么会有颜色，颜色又为什么与浓度有关呢？下面就讨论这个问题。一、光的互补及有色物质的显色原理1．光的波粒二象性光是能的一种表现形式，是电磁波的一种。光在真空中以直线方式传播，在不同的介质处发生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等现象。可用波长、频率、传播速度等参量来描述，即光具有“波动性”。光的颜色即由光的波长决定，人眼能感觉到的光称为可见光，其波长在400～750nrn之间。在可见光之外是红外光和紫外光。3溶液为什么会有颜色，颜色又为什么与浓度有关呢？下面就讨论这个同时，光也具有“粒子性”，光电效应就是一个很好的例子。光的粒子性理论认为，光是由“光子”（或称“光量子”）所组成。在辐射能量时，光是以一份一份的能量E的形式辐射的，同时光被吸收时，能量也是一份一份被吸收的。这每一份能量的大小为hυ。光子的能量与波长的关系为E=hυ=hc／λ式中E为光子的能量（J：焦耳），υ为频率，h为普朗克常数（6.63×10-34J·S），c为光速，λ为光的波长4同时，光也具有“粒子性”，光电效应就是一个很好的例子。光的粒因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。2。光的显色原理若把某两种颜色的光，按一定的强度比例混合，能够得到白色光，则这两种颜色的光叫做互补色。图4－1中处于直线关系的两种光为互补色。如绿光和紫光为互补色，黄光和蓝光为互补色等等。各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是溶液中有色质点（分子或离子）选择性地吸收某种颜色的光。实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收光的互补色。如一束白光通过高锰酸钾溶液时，绿光大部分被选择吸收，其它的光透过溶液。从互补色示意图可以看出，透过光中只剩下紫色光，所以高锰酸钾溶液呈紫色。5因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。566二、朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可以用吸收定律来描述。它是由朗伯定律和比尔定律相结合而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原子吸收分光光度计也符合这个定律。溶液对光的吸收当一束强度为I的平行单色光照到溶液时，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光则透过溶液，如图4-2所示7二、朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律788有：I0=Ia+Ir+ItI0--入射光强度Ia--吸收光强度Ir--反射光强度It--透射光强度通常由于Ir很小可忽略不计，上式可简化为I0=Ia+It透射光It与入射光强度I0之比为透光率或透光度，用T表示：T=It/Ia透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光度，用A表示：A=－lgT=lg1/T=lgIa/It9有：I0=Ia+Ir+It9吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为A＝KCL式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K——某溶液的消光（吸收）系数；C——溶液的浓度；L——光程，即溶液的厚度。10吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来消光系数K是一个常数。一种有色溶液对于一定波长（单色光）的入射光的K值具有一定的数值。若溶液的浓度以摩尔／升表示，溶液厚度以厘米表示，则此时的K值称为摩尔消光系数。摩尔消光系数是有色化合物的重要特性之一，根据这个数值的大小，可以估计显色反应的灵敏程度。从上式可以看出，当K和L不变时，光密度E与溶液浓度C成正比关系，也可以说，当一束单色入射光经过有色溶液且入射光、消光系数和溶液厚度不变时，吸光度A是随着溶液浓度而变化的。11消光系数K是一个常数。一种有色溶液对于一定波长（单色光）的这种单色光与有色溶液的关系称为朗伯-比尔定律。光电比色计和分光光度计的比色分析方法就是根据这一定律来进行的。但是，朗伯-比尔定律只适用于单色光和低浓度的有色溶液。三、朗伯-比尔定律的应用1．等吸光度法从朗伯-比耳定律可知，当用同一光源照射同一物质的不同浓度溶液时，若吸光度相等，则两溶液各自的浓度和透光液层厚度的乘积也相等。利用此关系在可见光区用眼作检测器（目视比色法），即可求出待测溶液的浓度。12这种单色光与有色溶液的关系称为朗伯-比尔定律。光电比色计和分2．计算法根据被测溶液浓度的大致范围，先配制一已知浓度的标准溶液。用同样的方法处理标准溶液与被测溶液，使其成色后，在同样的实验条件下用同一台仪器分别测定它们的吸光度。在标准溶液中：As=KsCsLs在待测溶液中：Ax=KxCxLx如果测定时选用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波长的单色光，保持温度相同，则K也相等。将两式相除可得As/Ax=Cs/Cx132．计算法13由此可见，在满足上述条件下，吸光度与溶液成正比。如果设计一种仪器，可以测量吸光度A值，则待测溶液的浓度即可求出Cx=Ax/As·Cs由于仪器的性能和实验环境在不断的变化，所以在采用计算法时，必须每次都要对标准液和被测液进行测量，然后利用上式进行计算，否则会带来较大的测量误差。由于一般光电比色计在结构上有不少偏离朗伯一比耳定律的地方，故欲得到较准确的结果，常采用标准曲线法。14由此可见，在满足上述条件下，吸光度与溶液成正比。如果设计一3．标准曲线法这种方法分以下几步：（1）先配制五种以上标准浓度的溶液。（2）测出每种溶液的吸光度A。（3）做A～C标准曲线图，如图4－3所示。有了标准工作曲线便可对溶液进行测量。在同样的条件下，用仪器测出A后，查标准曲线即可得被测溶液的浓度值Cx。153．标准曲线法151616171718181919核酸的定量分光光度计显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm，蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。20核酸的定量分光光度计显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如蛋白质的直接定量（UV法）蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。21蛋白质的直接定量（UV法）蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净比色法蛋白质定量Lowry法：以最早期的Biuret反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物质的蛋白不适合此种方法。BCA（Bicinchoninineacidassay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特点是，敏感度好，是Lowry和BCA两种测试方法的2倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry，BCA反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。22比色法蛋白质定量Lowry法：以最早期的Biuret反应为基细菌细胞密度（OD600）

实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。23细菌细胞密度（OD600）23主要技术指标1.样品量：0.5-5ul2.灵敏度dsDNA：2-20000ng/ul3.单机版操作:内置软件4.操作方式:彩色触屏和按键，可外接鼠标键盘5.测试协议：核酸，蛋白，菌液，细胞裂解物，UV-VIS6.数据输出形式：数据图表输出，通过U盘，CSV格式文件，数据&图表输出或112mm宽打印纸输出，7