免疫组化基本理论课件

.完全抗原(Completeantigen):大多数蛋白质和部分大分子多糖等,分子量MW)大.半抗原(lapten):大部分多糖类脂和多肽等MW小.仅具免疫反应性.半抗原抗体的生成:用戊二醛等将钥孔血蓝蛋白(Keyholelimpethemocyanin,KLH,牛血清白蛋白Bovineserumalbumin,BSA),卵白蛋白Ovalbumin,OVA或甲状腺球蛋白(Thyroglobulin)等大分子载体,Carrier)和MW小的半抗原结合后免疫动物但机体可产生载体抗体.完全抗原(Completeantigen):大多数蛋白12特性a.异物性异种或同种异体物质:种属关系越远免疫原性越大,交叉反应越弱.反之亦然自身组织:特殊情况下释放隐蔽的抗原引起自身免疫b.理化特性:分子量>10kDa,MW越大,结构越复杂免疫原性越强c.特异性:抗原具有只与相应抗体发生结合反应的特性,其物质基础是抗原分子表面少于8个氨基酸,糖或核苷酸残基构成的表位(Epitope或称抗原决定簇(Antigenicdeterminant.抗原一级和空间结构影响抗原决定簇抗原决定簇越多,间距越大,免疫原性越大酶解或变性可暴露蛋白内部的抗原决定簇2特性2B抗体免疫球蛋白(mmunoglobulin,lg)1.分子结构:一对重链(Heavychain和一对轻链Lightchain通过二硫键连接成对称性的“Y”形在氨基端N端),重链的14Antigen-binding和轻链的12组成可变区regionsVariableregion,V区),其氨基酸排列顺序变化很大用于结合不同的抗原决定簇在羧基端(C端),重Lightchain链的34和轻链的12组成稳定区(Constantregion,CHeavychain区),其氨基酸排列顺序比较恒定FCB抗体免疫球蛋白(mmunoglobulin,lg)32.功能结构a.抗原结合片段(Antigenbindingfragment,Fab:“Y"顶部.每个Fab由一条完整的轻链和一条不完整的重链组成因一个抗体有两个Fab,因此可结合2个抗原b.可结晶片段(Crystallizablefragment,Fc):“Y"基部由两条不完整的重链组成,可与补体等结合,是调节抗体生物活性的部分C.绞链区(Hingeregion)连接Fab和Fc的狭窄区,易弯曲扭转或被木瓜酶和胃蛋白酶解.调理作用(Opsonization):免疫细胞对lG结合的抗原反应迅速且激烈,因为这些细胞本身有lgG的Fc受体3.抗原性抗体分子量约150kDa,具有抗原性2.功能结构44.分类a.lgG:最多.是能穿过胎盘屏障的唯一类型.blgA:分泌物中的主要类型蛋白J结合2-3个gA单体,并与分泌蛋白结合后形成分泌性lgA(SlgAc.lgM:免疫反应中首先出现的类型B细胞CM上单体lgM与抗原的结合,对B细胞转变成浆细胞非常重要.血循环中五聚体lgM与抗原结合后,能激活补体系统,该系统包括肝脏合成的C3等20余种蛋白,能增强免疫反应dlgD:B细胞CM,功能不明e.lgE:其Fc段与肥大细胞CM的Fc受体结合,引起脱颗粒造成过敏反应Allergy)4.分类5IntestinallumenSecretoryEnterocyte吨小肠上皮吸收细胞OTandB与M细胞合作,形HelperTlymphocyteBlymphocyte成分泌性!A(SgAlymphocyteIntestinallumen6gEreceptorAdenylatecyclaseFusianofgranulesATPMicrofilamentsHeparinproteinkinaseInactivECF-AExocytosisLeukotrieneslgE的Fc段与肥大细胞cM结合,引起脱颗粒造成过敏反应gEreceptor75.生成a.多克隆抗体(Polyclonalantibody.抗原分子上有许多不同的抗原决定簇,免疫动物体时每个抗原决定簇激活一种合成抗体的细胞克隆,产生许多种lgG(针对同一抗原的多种抗体混合物,即多克隆抗体*.多克隆抗体易与类似抗原(即含类似抗原决定簇)发生交叉反应.多克隆抗体分离自动物血清,也称抗血清b.单克隆抗体(Monoclonalantibody):.用特异性抗原免疫小鼠,分离抗体产生细胞与不产生抗体但能不断增殖的细胞系骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤(Hybridoma)将杂交瘤细胞克隆化,每个杂交瘤细胞只产生一种抗体,对一个抗原决定簇发生反应,即单克隆抗体5.生成8C.抗原抗体反应:抗原和抗体发生特异性结合,解离系数101M抗原抗体反应的高度特异性,高亲合力及形成不溶性复合物等特性是免疫组化的基础l.常用标记物及其检测:荧光染料,酶,生物素和胶体金等用于标记抗体,抗原,蛋白A和凝集素等A.荧光染料1.简介:即荧光色素,能吸收特定波长的高能量光波而受到激发(Excitation),进而以特定波长荧光)将能量发散mon异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FTc)490~5→520~30nm,黄绿色b.四甲基异硫氰酸罗达明(Tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC:550620nm,橙红色C.抗原抗体反应:抗原和抗体发生特异性结合,解离系数101M9TRITC-conjugated2ndantibodiesshowvimentin.FITCatedphalloidinFITC-conjugated2ndantibodiesshowsactinsdaPishowsnucleiinshowtubulinsPishowsnucleusculturedAGMKC(AfricanGreenHelacellsMonkeykidneycells,verocelllineTRITC-conjugated2ndantibodie10免疫组化基本理论课件11免疫组化基本理论课件12免疫组化基本理论课件13免疫组化基本理论课件14免疫组化基本理论课件15免疫组化基本理论课件16免疫组化基本理论课件17免疫组化基本理论课件18免疫组化基本理论课件19免疫组化基本理论课件20免疫组化基本理论课件21免疫组化基本理论课件22免疫组化