进出口食品中耐热大肠菌群快速计数法

《出口贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法》编制说明1.任务来源根据国家出入境检验检疫总局2011年下达的标准编写任务通知（计划编号：2011B145），由福建出入境检验检疫局主持中华人民共和国国家出入境检验检疫行业标准《出口贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法》的编制起草工作。2.目的和意义贝类，多指软体动物门中的瓣鳃纲（或双壳纲）动物，一般体外披有1~2块贝壳，常见的有牡蛎、贻贝、蛤、蛏等。由于贝类生长位置较稳定，一旦遇到污染，很难回避；且贝类多属于滤食型生物，在进食食物的同时，也将水中的有毒有害物质吸入体内。随着近海沿岸水域人类活动的日益频繁，近几年贝类受到到大肠菌群、粪大肠菌群污染的事件时有报道。大肠菌群、粪大肠菌群作为常用的指标菌，被广泛应用于各类水产品的检验。目前，系统内尚无专门针对贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测的标准方法。因此本制标项目将在现有的相关国家标准和检验检疫行业标准的基础上，参考国外相关检测方法，研究制定贝类（及其产品）适用的大肠菌群、粪大肠菌群检测方法，以适应日益增长的技术执法中对贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测的需要。“贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法”目前无相同的国家标准和行业标准，我国现行的国家标准“食品卫生微生物学检验水产食品检验”（GB/T4789.20-2003）未规定粪大肠菌群检测方法，“鲜、冻动物性水产品卫生标准”（GB2733-2005）、“出口活贝类检验规程”（SN/T0375-1995）等相关国家行业标准也未就贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法进行规定。本制标项目将现有的相关国家标准和检验检疫行业标准的基础上，参考国外相关检测方法，结合多年来国家标准、行业标准实际应用情况，吸收新的检测技术或手段，研究制定新的贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法，并进行验证和编制。3制标依据本标准按照GB/1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求进行编写。其中技术路线参照美国食品药品管理局（FDA）《细菌分析手册》第4章大肠杆菌和大肠菌群计数（2002年）（BacteriologicalAnalyticalManual，Chapter4:EnumerationofEscherichiacoliandthecoliformbacteria,2002）进行修改。引用了如下标准的部分内容：GB/T4789.20食品卫生微生物检验水产食品检验GB17378.7海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南参考比较了GB4789.3《食品微生物学检验大肠菌群计数》、GB4789.39《食品卫生微生物学检验粪大肠菌群计数》以及GB17378.27《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测》等方法，制订适用贝类的大肠菌群、粪大肠菌群检测方法。4研究过程在建立了本方法（以下称其为“贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法”）后，对其进行了方法验证。方法验证包括两部分：室内方法比较研究和室间协作试验。4.1室内方法比较研究以检测人工污染相同浓度添加菌样品的方式，比较了贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测方法采取200g取样量及5管接种培养法，与通常食品中25g取样量及3管接种法的差异；同时，还研究了贝类大肠菌群、粪大肠菌群相对准确性和特异性。大肠菌群、粪大肠菌群作为卫生指示菌达到一定数量才表明贝类卫生状况差，贝类中检测出的大肠菌群、粪大肠菌群数如果很低并没有多少实际意义，因此未进行该方法的检出限研究。4.2室间协作试验组织了6个实验室，其中包括一家生产出口贝类产品的企业实验室，采用1种贝类样品，3个污染水平的实验室间协作实验，确定了本方法的重复性值和再现性值。5研究内容5.1室内方法比较研究5.1.1取样量及接种培养法的比较本方法对贝类样品的取样量为200g，采用5管法接种培养，不同于通常食品25g的取样量，采用3管接种培养。采用相同浓度的人工污染贝类样品，按两种不同取样量、不同的接种管数进行检测，比较检测大肠菌群、粪大肠菌群结果的差异。方法5.1.1.1.1基质：经过热处理的花蛤、贻贝样品，剥去双壳取蛤肉及壳瓣内液体均质（不加稀释液），经菌落总数测定为不含菌的阴性样品。5.1.1.1.2菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922购自上海汉尼公司。将冷冻保存的大肠埃希氏菌菌株置室温回温后，接种于营养肉汤中制成菌悬液，至36.5°C培养18〜24h，取1mL菌液肉汤加入9mL稀释液制成1/10的菌液稀释液后，按1/10做成系列稀释度，选择合适系列稀释度的菌悬液备用。5.1.1.1.3接种水平：用上述菌悬液的合适浓度的稀释液分别接种2种贝类基质，每种贝类按101〜102CFU/mL、102〜103CFU/mL、104〜105CFU/mL分别接种3个样品，每个样品为225g，经过均质混匀后，分成200g、25g待检。5.1.1.1.4分析：按贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测方法，取样量为200g，采用5管法；另外，按通常的取样量为25g，采用3管法。比较两种不同取样量、不同的接种管数检测结果的差异。检测结果见下表。表1比较两种不同取样量及不同接种管数培养法的检测结果污染水平取样量、接种法花蛤贻贝检测结果（MPN/g）检测结果（MPN/g）低200g，5管法1308025g，3管法12075中200g，5管法940180025g，3管法4302100200g，5管法54003400

高25g，3管法43001500t值t=1.784<(t005=%571)P值P>0.05'从对两种人工污染样品三个接种水平两种取样量计数结果可以看出，两种方法所得结果经统计学处理，无显著差异，从检测结果来看，取样量为200g的检测数值大部分大于取样量为25g的检测数值，说明取样量大检出的菌量会相对多点，也可能与试验样本数不够多有关系。5.1.2相对准确性方法2.1实验菌株菌液制备采用5.1.1.1制备的基质，分别称取四份各200g花蛤肉均质待用。添加菌液制备同5.1.1.2，将过夜培养的菌悬液，10倍递增稀释至所需浓度（本实验采用10-6、10-7、10-8、10-9四种稀释度），每个稀释度取1mL分别添加到四份200g花蛤肉中均质混匀，分成四组，按照贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法检测，同时用常用的3管法计数所添加菌液含菌量。结果表2大肠菌群数量的检测结果组别贝类大肠菌群检测方法所添加菌液含菌量阳性反应管数MPN（每克）阳性反应管数MPN（每克/毫升）95%可信限1g0.1g0.01g1g0.1g0.01g下限上限155416033211018410554160553925539255254254222322214435422254117543285321434313.321120.454.24323.44101.73412.44403.44000<0.2000<0.3—0.95000<0.2

000<0.2000<0.2000<0.2由于只添加大肠埃希氏菌1种菌，粪大肠菌群的检测结果与大肠菌群的检测结果基本一致，不再单独列表说明。以上试验选用冻煮花蛤作为人工污染样品基质，用传统3管法对添加到蛤肉中的菌液含大肠埃希氏菌的量进行计数，同时，采用贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法检测人工污染贝类中的菌量。从以上几种浓度菌液的计数结果可以看出，用该方法所得计数结果，基本落在所添加菌液含菌量的95%可信限范围内，因此，采用该方法能够准确检测出贝类中所含的大肠菌群、粪大肠菌群的数量。5.1.3特异性方法选取15株大肠菌群菌株和25株非大肠菌群菌株，将40株菌分别接种到经过热处理为不含菌的40份花蛤样品中，接种水平约为102cfu/mL，采用贝类大肠菌群检测法，按取样量与稀释液之比为1：2的比例混匀，各取2mL加入10mL双料LST管中，共接5管，只要5管中有一管产酸产气并经过BGLB证实，说明所添加的菌能够被检出判定为阳性，反之为未检出判定为阴性。结果贝类大肠菌群检测法的特异性见表3。表3贝类大肠菌群检测法特异性研究菌株中文名菌株学名菌株号菌株来源结果大肠埃希氏菌EscherichiacoliATCC25922购自上海汉尼公司阳性大肠埃希氏菌EscherichiacoliATCC8739福抗厂提供阳性大肠埃希氏菌Escherichiacoli44110购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌Escherichiacoli44155购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌Escherichiacoli44106购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌Escherichiacoli44103购自中国药品生物制品检定所阳性大肠埃希氏菌EscherichiacoliATCC10536购自陆桥公司阳性大肠埃希氏菌EscherichiacoliCC008本室分离菌株阳性阪崎肠杆菌EnterobactersakazakiiATCC29544购自陆桥公司阳性阪崎肠杆菌EnterobactersakazakiiATCC51329购自上海汉尼公司阳性阪崎肠杆菌EnterobactersakazakiiATCC50205上海局提供阳性肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae46117购自中国药品生物制品检定所阳性

肺炎克雷伯氏菌KlebsiellapneumoniaeATCC4352购自上海汉尼公司阳性产酸克雷伯氏菌KlebsiellaoxytocaATCC700324生物梅里埃公司提供阳性阴沟肠杆菌EnterobactercloacaeCC031本室分离菌株阳性弗氏柠檬酸杆菌CitrobacterfreundiiATCC8090购自上海汉尼公司阴性弗氏柠檬酸杆菌CitrobacterfreundiiCC029本室分离菌株阴性布氏柠檬酸杆菌CitrobacterbraakiiCC012本室分离菌株阴性普通变形菌ProteusvulgarisATCC49132购自上海汉尼公司阴性奇异变形菌ProteusmirabilisATCC43072购自上海汉尼公司阴性奇异变形菌ProteusmirabilisCC010本室分离菌株阴性迟钝爱德华氏菌EdwardsiellatardaATCC15947购自上海汉尼公司阴性甲型副伤寒沙门氏菌SalmonellaparatyphiACC002福建CDC提供阴性猪霍乱沙门氏菌SalmonellacholeraesuisATCC13311福抗厂提供阴性鼠伤寒沙门氏SalmonellatyphimuriumATCC14028购自上海汉尼公司阴性肠炎沙门氏菌SalmonellaenteritidisATCC13076购自上海汉尼公司阴性肠炎沙门氏菌Salmonellaenteritidis5041购自中国药品生物制品检定所阴性浦那沙门氏菌SalmonellapoonaNCTC-4840购自上海汉尼公司阴性宋内氏志贺氏菌ShigellasonneiATCC25931购自上海汉尼公司阴性痢疾志贺氏菌Shigelladysenteriae51252购自中国药品生物制品检定所阴性蜡样芽孢杆菌BacilluscereusATCC11778购自上海汉尼公司阴性副溶血性弧菌VibrioparahaemolyticusATCC17802购自上海汉尼公司阴性副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus1.1997购自中科院微生物所菌种中心阴性溶血性链球菌Streptococcushemolytics33210-4a购自中国药品生物制品检定所阴性铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaATCC27853购自上海汉尼公司阴性金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538福抗厂提供阴性表皮葡萄球菌StaphylococcusepidermidisATCC12228福抗厂提供阴性单增李斯特氏菌ListeriamonocytogenesATCC7644购自上海汉尼公司阴性英诺克李斯特ListeriainnocuaATCC33090购自上海汉尼公司阴性氏菌购自中科院微生物所 阴性粪肠球菌Enterococcusfaecalis1.013购自中科院微生物所 阴性菌种中心从上表可以看出，采用贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法，对贝类中添加的15株大肠菌群菌株均能够检出，对贝类中添加的25株非大肠菌群菌株均未检出，说明本方法特异性为100%。5.2室间协作试验5.2.1室间协作试验通知进行协作试验之前向各实验室发送“《出口贝类中大肠菌群、粪大肠菌群检测方法》室间协作实验的通知”，说明协作试验目的、内容、时间安排等信息。5.2.2测试样品5.2.2.1样品基质本次试验样品基质选用经过热处理的文蛤，将文蛤去壳，取蛤肉及壳瓣内液体均质(不加稀释液)，并用平板计数法检查文蛤中大肠菌群、粪大肠菌群数，确定该样品里不含有的大肠菌群、粪大肠菌群数。将均质好的文蛤样品分装到无菌样品瓶中，每瓶分装200g均质样品。菌株大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC25922和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)ATCC8090购自上海汉尼公司，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)44110购自中国药品生物制品检定所。将这3株菌分别接种在平板计数琼脂平板上，37°C过夜培养。从平板上取菌混和于磷酸盐缓冲液(Butterfield’sbufferedphosphatediluent)中，制备成混合菌悬液，然后用磷酸盐缓冲液进行10倍系列稀释。5.2.2.3人工污染样品贝类样品制成高、中、低三个污染水平的样品。将装有已均质好的蛤肉的样品瓶分成3组，选取3个不同浓度的菌悬液等量添加到三个样品基质中，每瓶添加的菌液为1mL，混匀。制备好的样品的污染水平大致为：高污染浓度约为104MPN/g(mL)〜105MPN/g(mL)，中污染浓度约为102MPN/g(mL)〜103MPN/g(mL)，低污染浓度约为10】MPN/g(mL)〜102MPN/g(mL)。样品制备好，编号后立即放于冰箱冷冻保存。5.2.3参加实验室邀请了检验检疫系统、福建CDC、水产品加工企业的微生物检测实验室共6个作为参加实验室，实验室编号为1〜6。5.2.4样品分发每个实验室接收到3份样品，样品标记为样品1、样品2、样品3。发送样品时，从冰箱中取出样品用泡沫保温盒(内有冰袋)包装，一早用快递寄往参加实验室，随样品寄送“室间协作试验作业指导书”。样品抵达实验室后，立即放于冰箱冷冻保存，直至约定的检测日期。5.2.5样品检测6个实验室按照“室间协作试验作业指导书”的要求在约定日期同时开始检测样品。每个实验室采用贝类大肠菌群、粪大肠菌群检测法检测3份样品中的大肠菌群、粪大肠菌群。5.2.6协作试验数据分析检测结果记录在统一的记录表上，交给本次协作试验组织者。全部检测结果数据转化成以10为底的对数再用于统计分析。5.2.7结果和讨论6个实验室参加了此次协作试验，按照规定的时间，检测了3份样品。检测结果见表4,统计分析结果见表5。 表4贝类样品中大肠菌群、粪大肠菌群协作试验结果 样品1（低污染） 样品2（中污染）实验 大肠菌群 粪大肠菌群 大肠菌群 粪大肠菌群 大，室编结果值对数值结果值对数值结果值对数值结果值对数值结果值号（MPN/g） （MPN/g） （MPN/g） （MPN/g） （MPN/g1391.59221.349402.974602.66280002261.41211.324902.692302.36240003341.53221.346302.803302.52350004241.38211.3212003.087002.85920005321.51261.417902.904802.6