支原体检测（DNA法）SOP

支原体检测（DNA法）SOP编号：SOP-ZL006-001页码：1/5版本：01修订号：00机密等级：秘密起草人起草日期颁发部门质量管理部审核人审核日期批准人批准日期生效日期分发数量研发部[]质量管理部[]综合管理部[]生产管理部[]市场销售部[]财务部[]目的规定新生牛血清中支原体DNA荧光法检测操作程序。指导操作者按本程序进行新生牛血清支原体DNA荧光法检测的操作。适用范围本程序包括细胞培养、加样、染色、镜检等操作。适用于新生牛血清支原体DNA荧光法检测操作全过程。职责3.1质控部负责本程序的起草3.2总经理负责本程序的审批3.3质控部检验人员负责本规程的操作定义4.1DNA脱氧核糖核酸Vero非洲绿猴肾细胞引用标准《中华人民共和国药典》四部2015版材料及设备6.1试剂6.1.1供试品及参考品/标准品6.1.3化学药品及试剂6.1.4支原体荧光染色试剂盒（记录厂家、批号和效期）6.1.5纯化水，记录批号。6.1.6Vero细胞（记录细胞代次）6.1.7细胞生长液，记录批号。配制参见《细胞生长液配制程序》SXRS-SOP02-1-0-59。6.2设备6.2.1超净台。参见《超净工作台使用与维护程序》SXRS-SOP02-1-0-426.2.2校验效期内的荧光倒置显微镜1台（记录型号，编号）6.2.3校验效期内的37℃CO2孵箱1台（记录型号，编号）。使用参见《CO2孵箱使用、灭菌及维护程序》SXRS-SOP02-1-0-41。6.3玻璃器皿及辅助用具/易耗品6.3.1经过灭菌处理的操作衣、2ml吸管若干，盖玻片，1个/批。如经高压灭菌则记录高压编号。6.3.2无菌医疗用品无菌帽、无菌口罩和橡胶检查手套。记录批号。6.3.375%酒精棉，参见《75%酒精棉配制程序》SXRS-SOP02-1-0-70。记录批号。6.3.4烧杯.6.3.5六孔板，1个/2批供试品6.3.6载玻片，2个/批供试品流程图无内容8.1试验前的准备8.1.1检定用具的清洗准备参见《物品准备程序》，在灭菌72小时内使用。8.1.2物料的进入8.1.2.1灭菌物品放入操作间，记录房间号。8.1.2.275%酒精棉、洗瓶、烧杯及试剂盒放入操作间。8.1.2.3带盖废物桶放入操作间。8.1.2.4人员更衣进入操作室。参见《人员进出洁净厂房程序》。8.1.2.5打开超净台，紫外灯消毒50分钟。操作前关闭紫外灯。8.2检测程序8.2.1将染色试剂盒中的10倍浓缩染液拿到室温下，摇匀。8.2.2将浓缩染液用HANK'S平衡盐作1：10稀释，避光。8.2.3细胞培养8.2.3.1把无菌盖玻片放入六孔板中。8.2.3.2用吸管在六孔板中加入Vero细胞液，1ml/孔，让细胞生长在盖玻片上。8.2.3.3把六孔板放入37℃孵箱，过夜孵育。8.2.3.4清场。参见《QC清场管理程序》。填写试验记录和清场记录。复核人复核并签字。8.2.4加样8.2.4.1启动超净台。8.2.4.2把六孔板从孵箱中拿出，放入超净台。8.2.4.3用吸管吸取2ml供试血清加入1个培养孔。8.2.4.4更换吸管，分别吸取其它批供试血清加入不同培养孔中，即2ml/孔，2孔/批血清。8.2.4.5每板加样完毕，盖上盖子。8.2.4.6六孔板重放回37℃孵箱培养48-72小时，中途勿动。8.2.4.7清场。参见《QC清场管理程序》。填写试验记录和清场记录。复核人复核并签字。8.2.5染色8.2.5.1从孵箱中拿出细胞板，用吸管吸出培养液，每孔留1ml左右。8.2.5.2更换吸管，每孔加1ml固定液固定5分钟。8.2.5.3倒掉孔中液体，再每孔加固定液固定10分钟，加液量以能覆盖盖玻片为准。8.2.5.4倒掉固定液，用镊子取出盖玻片放于六孔板盖上，风干。8.2.5.5每张风干后的盖玻片加1ml稀释好的染液避光染色10-30分钟。同时把试剂盒带的阴性和阳性对照染色。8.2.5.6用洗瓶把盖玻片冲洗3次，再风干。8.2.6镜检8.2.6.1细胞面朝下把盖玻片封闭在洁净载玻片上，拿到荧光显微镜下观察。参见《荧光倒置显微镜使用与维护程序》。8.2.6.2填写荧光显微镜使用记录。8.2.6.3完成试验记录。复核人复核并签字。8.2.6.4清场。参见《QC清场管理程序》。填写清场记录。复核人复核并签字。8.3仅见细胞核呈现荧光，判为阴性；细胞核周围有大量荧光颗粒或丝状点集于细胞表面，判为阳性。8.4完成试验记录，交主管复核确认注意事项9.1.严格按照GMP要求规范操作，以防止检定结果不成立。9.2.注意不得混淆不同名称和批号供试品9.3.使用的计量器具应经过计量校验9.4出现超标结果，应在试验记录中如实记录。9.5出现OOS情况，应及时报告主管。参见《质量检验超出标准调查分析程序》SXRS-SOP02-1-0-67，完成OOS记录。附录及派生记录支原体检测DNA记录F-SOP-ZL006-01相关文件《细胞生长液配制程序》《CO2孵箱使用、灭菌及维护程序》《物品准备程序》《75%酒精棉配制程序》《人员进出洁