蔗糖酶的提取分离

蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0,最适温度为45°C。关键词：蔗糖酶、酶学性质1前言蔗糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26）又称转化酶（Invertase）。可作用于0-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高，可用以转化蔗糖，增加甜味,制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。本实验对酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。2材料与方法2.1材料与设备2.1.1实验材料酵母、活性干酵母、壳聚糖2.1.2试剂及配制方法葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、NaHPO、KHPO、MgSO、NaCl、NaOH、NaCO、盐2 4 2 4 4 2 3酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。95%乙醇溶液、DEAE-SepharoseFastFlow、1mol/L醋酸溶液、0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH值7.3）0.05mol/LTris-HCl缓冲液（内含0.5mol/LNaCl溶液，pH值7.3）葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80C烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4C保存期约一星期）。1%3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100g溶于400mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH5g，3,5-二硝基水杨酸5g，苯酚1g，亚硫酸钠0.25g，搅拌全溶。冷却后定容至500mL，储于棕色瓶室温保存。10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml0.1mol/LpH7.8Tris-HCl缓冲液1%戊二醛溶液：将4mL25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL0.2mol/LpH4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠，溶解于800ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至1000mL。1mol/LNaoH溶液：4gNaoH溶解于100ml蒸馏水中2.1.3实验器材微生物恒温培养箱、紫外分光光度计、超净工作台高速离心机、恒温水浴锅、层析柱(1.0cmx10cm)、梯度混合器、核酸蛋白检测仪、台式记录仪移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等。2.2实验方法2.2.1酵母发酵液制备2.2.1.1培养基配置斜面培养基(豆芽汁葡萄糖培养基)：TOC\o"1-5"\h\z豆芽汁浸汁 100mL葡萄糖 5.0g琼脂 2.0g自然pH0.1MPa高压蒸汽灭菌20min摇瓶培养基：蔗糖 20.0g/L蛋白胨 5.0g/LNa2HPO4 4.0g/LMgSO4 0.5g/LKH2PO4 1.0g/LpH 5.0~5.50.1MPa高压蒸汽灭菌20min2.2.1.2试验方法2.2.1.2.1斜面培养基的制备及斜面接种称取新鲜豆芽10.0g置于烧杯中，再加入100mL水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足到100mL，即制成10%豆芽汁。按每100mL10%豆芽汁加入5.0g葡萄糖，煮沸后加入2.0g琼脂，加热融化，补足水到100mL。分装、加塞、包扎，0.1MPa高压蒸汽灭菌20min。将灭过菌的斜面菌种培养基摆成斜面放置一段时间看有无染菌，用未染菌的斜面培养基接种菌种，该操作在超净工作台上完成。2.2.1.2.2斜面菌种的培养将接种后的斜面试管培养基置于28r的恒温培养箱中培养2d至斜面培养基上长满菌体。2.2.1.2.3液体培养准确称取蔗糖糖20.0g，蛋白胨5.0g，NaHPO4.0g，MgSO0.5g，KHPO1.0g，2 4 4 2 4加1000mL水加热，调pH5.0~5.5，每50mL培养基加到250mL三角瓶，包扎，0.1MPa高压蒸汽灭菌20min。将斜面菌体用接种环接种两环，在28°C的恒温摇床110r/min中培养2d。2.2.2酵母蔗糖酶的部分纯化2.2.2.1.破碎细胞取5g干酵母，加5g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30mL去离子水，研磨30min，在冰箱中冰冻约10min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移至大离心管中，12000r/min离心15min，弃去沉淀。留0.5mL上清液为第一组分。.加热除杂蛋白将上清液转入三角瓶，用1mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50C的水浴中，保温30min。在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之，以12000r/min的转速离心20min，弃去沉淀。留0.5mL上清液为第二组分。.乙醇沉淀量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液（预先放在-20C低温下的时间不少于30min），于冰浴中温和搅拌20min。然后以12000r/min的转速离心25min,小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀溶解在6mL0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH值7.3）中，搅拌（5min以上）使其完全溶解，以12000r/min的转速离心25min，取出0.5mL上清液作为第三组分，剩余部分（乙醇抽提液）进行第4步操作。2.2.3蔗糖酶酶学性质的研究2.2.3.1pH对蔗糖酶活动性的影响按下表配制7种缓冲溶液（公用）:将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。溶液pH缓冲试剂体积ml缓冲试剂体积ml2.50.2mol/L磷酸氢二钠2.000.2mol/L柠檬酸8.003.00.2mol/L磷酸氢二钠3.650.2mol/L柠檬酸6.354.00.2mol/L乙酸钠1.800.2mol/L乙酸8.205.00.2mol/L乙酸钠7.000.2mol/L乙酸3.006.00.2mol/L乙酸钠9.500.2mol/L乙酸0.507.00.2mol/L磷酸氢二钠6.100.2mol/L磷酸二氢钠3.908.00.2mol/L磷酸氢二钠9.470.2mol/L磷酸二氢钠0.532.准备二组各7支试管，第一组7支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6〜1.0的光吸收值（A650）。另一组7支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8ml。所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L）开始反应，反应10min后分别加入1mL1mol/LNaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5min,冷却后定容至25mL，然后测定A540的吸光值。画出不同pH下蔗糖酶活性（moles/min）与pH的关系曲线，注意画出pH值相同，而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。2.2.3.2温度对酶活性的影响本实验要测定0°C〜100°C，之间7个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。这7个温度是：30C、40C、50C、60C、70C、80C、90C。每个温度准备1支试管，以乙酸缓冲液作为缓冲液。2.2.3.2.1.确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2ml0.2mol/LpH4.9的乙酸缓冲液，0.2ml稀释的酶，加水至0.8ml加入0.2ml0.2mol/L的蔗糖开始计时，在室温下反应10min，后分别加入1mL1mol/LNaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5min,冷却后定容至25mL,然后测定A540的吸光值。须得到0.2〜1.0A的吸光度，准备一个水的空白对照管用于测定所有的样品管。测定上列各个温度下的反应速度，每次用1支试管，均加入0.2ml乙酸缓冲液均用水调至0.8ml，放入水浴温度下使反应物平衡30秒，加入0.2mol/L蔗糖0.2ml，准确反应10分钟，后分别加入1mL1mol/LNaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确反应5min,冷却后定容至25mL，然后测定A540的吸光值。记录每个水浴的准确温度。酶催化的各管A540值均进行酸催化的校正。画出酶催化的反应速度对温度的关系曲线。2.2.4酵母蔗糖酶的固定化.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联称取3g壳聚糖溶于98mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。称取8gNaOH置大烧杯中，加入180mL蒸馏水及20mL甲醇。将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。注意：为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10mL,随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥十水分。加入1%戊二醛溶液100mL，静置2h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。.固定化酶的制备将静置2h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。将实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液1mL用蒸馏水稀释至100mL,与偶联戊二醛的壳聚糖载体混合，静置偶联过夜。2.2.4.3.固定化酶的评价

分别测游离酶、固定化酶以及残留酶液的酶活力。具体如下:比色管号1234蔗糖溶液1mL1mL1mL1mL醋酸buffer1mL1mL1mL1mL游离酶/固定化酶01mL游离酶液1g固定化酶1mL残留酶液37©隹确反应10min,1mL1mol/LNaOH终止酶促反应水杨酸试剂1mL1mL1mL1mL沸水浴精确反应5min,冷却后定容至25mLA5403结果与分析3.1pH对蔗糖酶活动性的影响3.2温度对酶活性的影响oooooO53.2温度对酶活性的影响oooooO5050522113.3酵母蔗糖酶的固定化比色管号1234蔗糖溶液1mL1mL1mL1mL醋酸buffer1mL1mL1mL1mL游离酶/固定化酶01mL游离酶液1g固定化酶1mL残留酶液37©隹确反应10min,1mL1mol/LNaOH终止酶促反应水杨酸试剂1mL1mL1mL1mL沸水浴精确反应5min,冷却后定容金25mLA5400.2173.5750.3870.496活力回收=固定化酶总活力数溶液酶总活力数x100%=10.8%相对活力=固定化酶总活力数溶液酶总活力数-残留酶活力数x100%=12.6%4结论与展望通过初步的酶学研究，蔗糖酶的最适pH为5、最适温度为35^、固定化酶活力回收为10.8%，相对活力为12.6%。蔗糖酶在pH2.0〜