蝴蝶兰高效培养

组织培养的条件在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。（1）实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。（2）实验室组成：化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室。化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器.洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭菌器（如烘箱）等。无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。无菌室的建造要求严格，接种室宜小不宜大，一般7〜8平米，要求接种室干爽安静，清洁明亮，除出入口和通气口外，应当密闭，配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动，用紫外光灯灭菌后，能较长时间保持无菌状态。为避免消毒药品的腐蚀，地板、内墙和作业台应采用耐水、耐药的材料，如经过油漆，铺上瓷砖或玻璃，或采用磨光水泥等，通气口要安装排风扇，定期开机更换空气。无菌室设内外二间，外间小些，为缓冲室，供工作人员换衣、帽、鞋、口罩之用。备有衣帽钩和拖鞋架。内间较大，接种用，备有工作台，放物台，小型离心机，真空抽气机等。内外间分别安装紫外灯，操作前至少开灯20分钟。室内定期用甲醛和高锰酸钾熏蒸。主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。室内要求内壁保温和油漆，具有磨光水泥的或油漆过的地板，顶高以2.6m为宜，易于控制温湿度，窗户上要装双层密封玻璃窗。有窗户虽对保温保湿不利，但有自然光射入，对苗的生长和无菌有好处。室内要有足够的电源。室内要保持清洁，定期用20%新洁尔灭消毒，防止杂菌生长。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。培养架可分4—5层，上面安装30—40W日光灯照明，每天照明10—16小时左右，用自动定时器控制。温度最好保持在15—25°C左右。此外还可根据需要安置液体培养所需的摇床、转床等。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%〜80%为好，可安装加湿器。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。设备主要应有：空调机，供升降温用；加热器，供加热用；温度控制器，供恒温用；定时器，供控制光照时间用；培养架，供放置培养瓶用，培养架的框子用木制或三角铁制皆可，应漆成白色或银灰色，每层隔板可用玻璃或木料制成，但光照效果要好；日光灯供光照之用。2常用药品组织培养所需药品主要用于培养基的配制，也有部分用于消毒，主要有以下几类：（一） 消毒药品主要有次氯酸钠、次氯酸钙、双氧水、漂白精片、漠水、硝酸银等。（二） 无机盐类（inorganicelement）包括大量元素和微量元素两类，主要的盐类有KNO3、MgSO4・7H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2・2H2O、Fe2（SO4）3、Na2HPO4、CuSO4、NaNO3、Na2SO4、ZnSO4、MnSO4・4H2O、MnCl2・2H20、KI、H3BO3等，无机盐是供外植体吸收的基本营养成分，各有不同作用，如N、P影响蛋白质的合成，Ca、K、S、Mg影响酶活性等。（三）有机化合物（organiccompound）主要有蔗糖、维生素类（vitamin）肌醇（myo—inositol）、氨基酸（alminoacide）等。其中蔗糖是不可缺少的碳源，也是渗透压调节物质。维生素的主要作用是促进细胞分裂和诱导器官分化。氨基酸是蛋白质组成成分，也是有机氮源。（四） 植物生长调节剂（hormone）用于组织培养的主要有生长素、细胞分裂素及赤霉素三大类：生长素类（auxin）主要有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2,4—D和吲哚丁酸（IBA）。2,4一D有利愈伤组织生长，NAA、IAA、IBA有利于器官分化。2.细胞分裂素类（cytokinin）主要有激动素（KT）、6一苄基腺嘌吟（BA）、玉米素（ZT）等。其作用是促进细胞分裂与分化，其中KT能明显促进芽的分化而抑制根的形成。3.赤霉素（gibberellicacid）以GA3运用最广泛，有促进不定芽和幼株伸长的作用。（五） 有机附加物包括人工合成和天然的有机物，常用的有酵母提取物、椰乳、果汁等及相应的植物组织浸出液。对细胞和组织的增殖和分化有一定促进作用。此外琼脂在组培中作为凝固剂，是外植体的支持体，常用浓度为0.5—1%。（六）水培养基用水原则上使用蒸馏水，去离子水等，尤其在对化学成分要求较精确的试验中。但在组培苗的批量生产中，可选用自来水配制，以降低成本。组织培养的灭菌工作1、清洗植物组织培养用的各种玻璃器皿，特别是培养瓶和盛培养基的器皿，一定要严格清洗，以防油污、重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定的地方，便于取用。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在o.1MPa的压力下，锅内温度达121T。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0.1-0.15Mpa时，维持15-20min。对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5,其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）•在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到160-180〜C的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170°C持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。过滤灭菌（不耐热的物质）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。可用无菌的孔径0.20-0.45um的硝酸纤维素膜过滤菌类，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。紫外线和熏蒸灭菌（空间）•（l）紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。（2）熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。3、无菌操作植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程，如少有疏忽，都会造成无法挽回的后果，使工作前功尽弃。工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点：a.入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。匹入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。无菌外植体的建立外植体的选择与灭菌是植物组培快繁中的重要环节，它由原培养材料、灭菌剂、灭菌方法等因素决定，寻找快速、高效的灭菌方法，减少污染瓶的丢弃，对于降低成本具有重要的意义。1、方法对成功率的影响大量的试验证明，0.1%的升汞是最理想的杀菌剂，但灭菌时间要求极为严格。时间过短，杀菌不彻底，时间过长，会对组织细胞有杀伤作用，不利于外植体诱导分化。在杀菌方式的比较试验中看出，不同的清洗方式对外植体的杀伤率和成活率影响极大，通过磁棒搅动冲洗能够加大对升汞残留的冲洗，减少对材料的杀伤作用，降低褐化率，提高成功率。2、 外植体的幼嫩程度、灭菌条件对其成活率的影响外植体的幼嫩程度不同，其含菌量也不同，所需的灭菌条件也有差异。从酒精浓度、0.1%升汞灭菌时间两个方面进行试验，结果表明：幼嫩的外植体材料(如幼叶、幼芽、幼茎段)幼嫩的材料比老材料带菌量少，不仅所需0.1%的升汞的灭菌时间短，在7-9分钟之间能达到灭菌效果，而且酒精可用50%来代替70%，酒精浓度的降低，可以减少对材料的伤害，不降低其粘着效能，有利于升汞的杀菌作用，提高外植体的成活率。老的材料(如半木质化、木质化的茎段)茎段内生菌较多，皮部粗糙，所需0.1%升汞灭菌的时间就长(在9-12分钟之间)，且必需用70%的酒精，才能起到较好的灭菌效果。根据不同接种材料，采用不同的措施，就会减少不必要的失败和投资经费，提高成功率。3、 不同品种外植体及取材季节对成活率的影响在接种外植体时，有的材料易发生褐变现象，它的产生可分为两种形式：一种是由于细胞受胁迫条件等不利条件影响所造成的死亡或自然发生的细胞死亡而引起的；另一种是材料伤口处分泌出的酚类化合物引起的，前者可以通过采取适当的措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生褐变，而后者很难清除，严重影响外植体的诱导分化。只有选择合理的外植体，才能降低褐变现象，大部分易褐变的材料，从11月份到第二年2月份褐变率很低，随着进入生长季节，褐变率逐渐上升，在5、6、7、8月份达到最高峰，然后自9月份后褐变率逐渐下降直到不再发生，为此对易褐变的外植体应在11月到2月取材，通过培养箱内水培催芽取幼嫩部分，或待接种材料放入温室内，保持半木质化，可获得理想的原始培养材料。外植体所带菌的种类、数量与材料种类和取材季节有关，同时，材料成活率的高低与材料取材的时间及材料本身特性也有关。试验表明，上年11月份到下年4月份取材最好，4月份到6月份与9月份到11月份取材较好，6月份到9月份较差。试验中污染若以细菌为主则成功率高，如平邑甜茶、月季、樱桃、杨树等；以真菌为主则成功率低，如冬枣、花椒、茶树等；一品红由于本身分泌白色乳状物，灭菌较困难成功率亦较低。因此选择适宜的基因型材料，适时接种，可大大提高成功率，减少投资损失。母液和培养基的配制在实验中常用的培养基，可将其中的各种成分配成10倍、100倍的母液，放入冰箱中保存，用时可按比例稀释。配制母液有2点好处：一是可减少每次配制称量药品的麻烦，二是减少极微量药品在每次称量时造成的误差。母液可以配单一化合物母液，但一般都配成以下四种不同混合母液。应注意以下几个方面：A.药品称量应准确，尤其微量元素化合物应精确到0.0001克，大量元素可精确到0.01克。B.配制母液的浓度适当，一是长时间保存后易沉淀，二是浓度大，用量少，在配制培养基时易影响精确度。C.母液贮藏不宜过长，一般几个月左右，要定期检查，如出现浑浊、沉淀及霉菌等现象，就不能使用。D.母液应放在2—4°C的冰箱中保存。大量元素混合母液:指浓度大于0.5mmol/L的元素，即含N、P、K、Ca、Mg、S等六种盐类的混合溶液，可配成10倍母液，用时每配1000ml取100ml母液，配时要注意以下几点：a.各化合物必须充分溶解后才能混合。b.混合时注意先后顺序，特别要将钙离子与硫酸根离子，磷酸根离子错开，以免产生硫酸钙、磷酸钙等不溶性化合物沉淀。c.混合时要慢，边搅拌边混合。微量元素混合母液:指小于0.5mmol/L的元素即含除Fe以外的B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等盐类的混合溶液，因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，用时每配1000ml取10ml或1ml。配时也要注意顺次溶解后再混合，以免沉淀。铁盐母液:铁盐必须单独配制，若同其他无机元素混合配成母液，易造成沉淀。配法是将 5.57gFeSO4.7H2O水溶液缓慢加入到7.45gNa2—EDTA微沸水溶液中，并不断搅拌，最后定容到1000ml，用时每配1000ml培养基取5ml。有机化合物母液：主要是维生素和氨基酸类物质，这些物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独的母液，其浓度有每ml含0.1、1.0、10mg化合物，用时根据所需浓度适当取用。（5）植物激素：每种激素必须单独配制成母液，浓度为每ml含0.1、0.5、1.0mg激素，激素浓度的表示方法有两种，一种是ppm（或每升中mg数），另一种是mol.用时根据需要取用。由于多数激素难溶于水，它们的配法如下：1） IAAIBAGA3先溶与少量95%酒精，再加水定容到一定浓度。2） NAA可溶于热水或少量95%的酒精中，再加水定溶到一定浓度。3） 2,4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后，再加水定容至一定浓度。4） KIN和BA先溶于少量1mol的HCl中，再加水定容。5） 玉米素先溶于少量95%酒精中，再加水至一定浓度。2培养基的配置（1） 混合培养基中的各成分。先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液、有机成分，然后加入植物激素及其他附加成分。（2） 溶化琼脂。称取应加的琼脂和蔗糖，将琼脂浸泡到透明后，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全溶化后，把1加入，用pH试纸测pH值，并用0.1mol的NaOH或HCl调pH为5.6-5.8，最后加水定容至所需体积。（3） 分装。将熬好的培养基分装于培养瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口上，以防引起污染，然后用封口膜或瓶盖封口。（4） 灭菌。由于培养基内有丰富的营养物质，极利细菌和真菌繁殖，造成污染，影响组培的成功，一般有高温高压消毒和过滤消毒两种方法。1.高温高压消毒:一般用消毒锅消毒，注意消毒锅不能装的过满，采用三次放气灭菌法，即0.05Mpa下放三次气，在0.1Mpa维持15-20分钟。2.过滤消毒：一些易受高温破坏的培养基成分如IAA、IBA、ZT等，不宜用高温高压法消毒，可用过滤消毒，可过滤消毒后再加入已高温高压消毒的培养基中，过滤消毒应在无菌室或超净工件台上进行，以避免污染培养基。培养基的成分及其特点组织培养过程中，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的。因此，培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。所有这些物质，可概括为5大类：1.无机营养物植物生长必须的有13种元素：氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、硫（S）、铁（Fe）、硼（B）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、钼（MO）、氯（Cl）。前六种属大量元素，后七种属微量元素。培养基的各种盐类中均含有上述这些元素。无机氮可以两种形式供应，即硝态氮和铵态氮。有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，目前皆用螯合铁，即硫酸亚铁加乙二胺四乙酸钠配成。有机物质主要有两类：一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢、氧、氮等必要元素，如糖类（蔗糖、葡萄糖和果糖）、氨基酸及其酰胺类（如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺）；另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用，如硫胺素（B1）、毗哆醇（B6）、烟酸、生物素、肌醇、单核甘酸及其碱基（如腺嘌吟等）。植物生长刺激物质主要加入植物天然的五类激素物质及其人工合成的类似生长激素物质，如生长素中常用的吲哚乙酸、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸；细胞分裂素中常用的有激动素、6-苄基氨基嘌吟、玉米素；赤霉素类中常用的有赤霉酸；乙烯类中常用的有乙烯和乙烯利。其他附加物这些物质不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益。琼脂（agar）是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40°C即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90C以上的热水。琼脂条的用量在6-10g/L之间，琼脂粉的用量在3-4g/L之间若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。其他替代物，有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。活性炭(activecarbon)可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利；•活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5—10g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。抗生物质(antibiotic)，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5—20mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果更好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应。值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。5.其他对生长有益的未知复合成分常用的为植物的天然汁液，如椰乳、酵母提取物、荸荠汁、苹果汁、生梨汁等。他们的作用是供给一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质等。组织培养的方法和步骤第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质一吐温。第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10〜30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表。第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。③升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。④漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入浓度为0.08—0.12%的吐温20或80(一种湿润剂)，可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。灭菌剂使用浓度(%)持续时间(min)去除的难易效果次氯酸钙9〜105〜30易很好次氯酸钠25〜30易很好氯化汞0.1~15〜8较难最好抗菌素4〜50mg/L30~60中较好制备外植体将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。在操作中严禁用手触动材料。接种和培养（一）接种在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种1—2个，以防止交叉污染。（二）封口接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。（三）温度培养基大多应保持在25r左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。增殖外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。组培苗的炼苗移栽试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98%左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。组织培养的意义意义［1］快速繁殖优良品种、优良类型和珍贵种质资源。⑵脱除各类病毒，幼化复壮植物。［3］有效的培养新品种，创造新型植物种类。采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。［4］保存种质资源，避免基因的丢失和毁灭。［5］提供加工原材料，生产次生代谢物。如抗癌首选药物--紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。［6］基因工程，基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。特点：①培养条件可以人为控制：组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。生长周期短，繁殖率高。植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20—30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。蝴蝶兰的组织培养与快速繁殖1植物材料蝴蝶兰Lm品种的幼叶。2培养条件诱导培养基：MS+BA3.0+NAA0.2。继代培养基:MS+BA2.0+NAA0.5。在上述培养基中均加入蔗糖20g/L（克/升）,琼脂12g/L（克/升）,椰汁200mL/L（毫升/升）。育苗培养基:1/2MS+IBA1.5+NAA0.05,并加入蔗糖20g/L（克/升），琼脂12g/L（克/升），活性炭5g/L（克/升），椰汁200mL/L（毫升/升九培养温度25°C-28°C，每日光照10h-12h（小时）,光照强度1600lx-2000lx（勒克斯）。3培养方法与生长分化情况3.1外植体接种从蝴蝶兰植株上取下幼叶（以3-4月龄的植株最好），放在自来水下冲洗干净，然后放入烧杯内待用。在超净工作台上，将烧杯内的叶片用75%酒精消毒30s（秒），然后用无菌水清洗2-3遍，再用0.1%升汞溶液浸泡11min（分钟），最后用无菌水冲洗4-5遍。用无菌手术刀将叶片切成5mmx5mm见方的小块，平放或按极性接种在诱导培养基上，近轴面向上，每瓶不宜接种太多。3.2原球茎的诱导与增殖幼叶切块在诱导培养基上培养1-2月后，从每个叶片组织块上产生1-7个不等的原球茎，此时，在无菌条件下,将原球茎取出切割成几小块，转入继代培养基中，进行增殖培养。培养一段时间（60天左右）后，再进行分割转移，通过这种方式，原球茎可成倍增长。3.3小植株的培养将不需继代的原球茎转移到育苗培养基上分化出芽，并逐渐发育成丛生小植株。在无菌条件下，切开丛生小植株，将小植株转入育苗培养基上培养。不久，小植株生根，当小植株长到一定大小时，移入温室。切离丛生小植株时，基部未分化的原球茎及刚分化的小芽应接入诱导培养基中，作为种苗。一段时间后，将长大的种苗移出，种植，小苗及原球茎可继续增殖与分化。3.4移栽及管理当小植株长至4cm左右，叶3-4片，根2-3条时，即可移栽。将小植株带瓶移入温室2周左右，然后打开瓶塞炼苗3-5d（天），取出苗后，用水冲洗掉植株根部的培养基，将根部放于70%甲基托布津溶液中消毒4h（小时），药液浓度为1500倍。将苗吸干水分后阴晾1h（小时），然后定植于水苔育苗盘中。刚定植的植株应遮光50%左右，温度控制在18C-28C，湿度以80%-90%为宜，以后逐渐保持在70%左右。缓苗后（两周左右）逐步提高光照强度至6000lx-8000lx（勒克斯）。蝴蝶兰根部忌积水，喜通风和干燥，水分过多，易引起根系腐烂。刚出瓶的小苗应勤补水，中苗或大苗根据干湿程度浇水，一般7d（天）-10d（天）左右，基质变干，盆面发白时，宜浇水，浇水时要让整个植料湿透。4小结在蝴蝶兰的组织培养过程中，叶龄与成功率密切相关，取叶的实生苗年龄以3-4月为最好，其诱导率及每个外植体上的原球茎个数最高。叶切段大小与诱导率直接相关，切段太小，存活率低，以0.5cm左右为最好。此外，