黑曲霉糖化酶去糖基化

黑曲霉糖化酶去糖基化尼日尔对结构的影响，活性和稳定性摘要比较结构-功能的研究是建立在稳定的糖蛋白的碳水化合物可能发挥的作用，使用糖化酶（GA）作为一个模型系统。除了动力学性质，对高温稳定性，极端的pH值，高盐浓度与圆二色性，内在/外在荧光的研究，与蛋白质和亲和研究了疏水性配体。所有主要的性能有关的检查，有一个例外，糖基化提供在酶的功能特性的改进，特别是在关系到其热稳定性。结果的解释稳定的分子间相互作用的糖分子的规定。改进的蛋白质的刚性，减少表面疏水性似乎与聚集的预防是特别重要的，不可逆的重要机制热灭活法，在升高的温度下发生的1。 简介糖基化是一种重要的自然发生的蛋白质的共价键结构的修改。大多数分泌蛋白糖基化就成为越来越多的肽链进入内质网，之前的最后一个天然样折叠的状态达到。因此，这样的事件及其发生的原因有关的蛋白质的结构和功能的影响已被广泛的研究。有两种不同的蛋白质糖基化的类型：。-糖基化在羟基丝氨酸和苏氨酸残基和N-糖基化组在SAN的共识序列的天冬酰胺残基一x-ser/苏氨酸。糖蛋白的生物学功能是好的但是，在这些活动建立了碳水化合物的作用的功能是，在大多数情况下，不清楚有矛盾经常在文献［6］1-观察报告。糖化酶，也被称为淀粉葡萄糖苷酶EC3。2。1。3，是一个Exo淀粉酶去除从非还原糖两端的淀粉和其他碳水化合物的聚合物和低聚物7］。从真菌中提取的酶黑曲霉Aspergillus尼日尔有各种工业应用是广泛应用于水解淀粉，生产高果糖糖浆和糖，酒精发酵［8,9］。它被认为是打破（1,4）键速度比（1,6）。虽然在一个案例（1,6）债券，活动率只有0.2%个（1,4），这一数额甚至活动的目的是充分的工业应用-13［10］。产酶由多种微生物，以提取的黑曲Aspergillus尼日尔，泡盛曲霉和根霉被视为最重要的［14］。在所有的酶糖化酶家族组成的催化结构域和一个淀粉结合域是相互连接的一个。-糖基化剂［10］。酶包含一个非常特殊的碳水化合物组成的区域30在二或三糖链的形式（主要是甘露糖）15。在本研究中，遗传算法被选择作为一个模型糖蛋白的比较研究进行使用天然蛋白质结构和去糖基化的制备通过a-甘露糖苷酶的使用获得的。结果表明在酶的去糖基化，灵活性增强其热稳定性减弱。研究了不可逆的thermoinactivation结合的结构鉴定两种形式的特性表明，糖的损失分子在疏水性残基暴露蛋白质分子的聚集，从而促进在高温下更灵活的结构。2。 材料和方法2.1。材料从尼日尔曲霉糖化酶，a-甘露糖苷酶米-氨基苯硼酸，concanavalina-s4b和枯草杆菌蛋白酶得到了六西格玛（St.路易斯，钼，美国）。从默克是所有其他化学品（达姆施塔特，德国），试剂级。2.2。 酶的活性和蛋白含量的测定浓度比色法测定糖化酶在房间温度，以可溶性淀粉为16毫米的基板醋酸钠，pH值4.8。还原糖浓度从催化反应得到的测定二硝基水杨酸法根据贝恩菲尔德［16］。采用Lowry等人的蛋白质浓度的测定。［17］和Bradford方法［18］。2.3。 去糖基化酶糖化酶和a-甘露糖苷酶的治0.1M醋酸钠缓冲液（pH4.5），含0.1毫米氯化锌和0.1%（V/V）h-mercaptoethanol，在37-c24小时。三个单位的a-甘露糖苷酶被用来为每个1毫佐治亚州的碳水化合物的去除程度是通过利用SDS前面描述的［15,19,20,21］。的去糖基化的形式显示增强的移动性，大概由于更高程度的SDS结合［22］。这在早些时候的报告显示优势的协议在疏水性区域的碳水化合物部分的糖蛋白［15］。一个更大的亲和力的去糖基化形式与疏水性吸附剂的相互作用进一步支持这一结论（贾法里aghdam，J.和线形动物门一gorgani，M.，未发表的数据）。所有的尝试涉及使用尺寸排阻色谱分离失败两种形式。也有部分的甘露糖苷酶处理制备没有绑定到ConASepharose4B不均匀的凝胶。而，通过的流量从米-氨基苯硼酸亲和柱［23］提供相应的去糖基化的锋利的乐队形式（图1）。这随后被用作制备去糖基化的形式，在目前的工作中。2.4。 荧光测量荧光的研究是在珀金埃尔默进行了LS50B.固有荧光发光光谱仪用50银/毫升蛋白和激励确定280nm波长。发射光谱300和400nm之间。外在的荧光研究进行如前所述的［24-26］，以ANS（8—anilino-1-naphthalene-sulfonate）作为荧光探针。所有实验均在25-c与ANS进行了50是50的Ag/ml浓度的蛋白质，分别，在16mM醋酸钠缓冲液。激发波长350nm的使用。2.5。 荧光猝灭荧光猝灭是由另外进行2米的丙烯酰胺的蛋白质溶液（50的Ag/ml）。淬火数据的Stern-Volmer分析常数，常数，这是从的比例计算非调质和淬火的荧光强度，FO/F，利用关系/F=1+KSV［问］。这里q是猝灭剂的摩尔浓度［27］。内在蛋白荧光F被改正的丙烯酰胺内滤效应，F，后者被定义为F，利用4.3消光系数q丙烯酰胺在280nm2.6。 蛋白水解裂解本地和去糖基化的形式的蛋白水解裂解1 2 3 4 5遗传算法是由酶进行治疗（0.1毫克/毫升）图1。SDS本地和去糖基化的遗传算法：1车道，母语；2，amannosidase；3，GA的文摘本土，去糖基化的形式a-甘露糖苷酶；4,未结合的GA在消化cona-s4b分数；5未结合的GA消化的米-氨基苯硼酸亲和分数矩阵。进一步的细节，在材料和方法。用不同浓度的枯草杆菌蛋白酶，使用50毫米硼酸，氯化钙10毫米，pH值10。消化进行了45-c6h和所需的量被免职SDS反应混合物。2.7。圆二色谱（CD）的测量CD测量使用该进行（东京日本）配备一个恒温j-715分光偏振计一控制单元支架。TM测量了使用CDspectropolarimeter（该j-715）使用0.1毫克/毫升的热变性蛋白质浓度在222个记录的CD信号变化的监测nm作为样品温度的函数。增长率在温度为1/min,调整2.8。 热稳定性本地和去糖基化酶制剂（0.1毫克/毫升）在醋酸钠缓冲液孵育在不同温度。每隔一定时间，取出样品在冰上冷却，剩余的活性测定。相同的酶的活性保持在冰整个解决方案该程序被认为是控制（100%）。2.9。 pH稳定性的测定混合缓冲液中含有醋酸，盖帽和Tris，每在40mM的浓度和pH值调整到指定的使用。该过程涉及使用100铝的自由和去糖基化的形式（0.1毫克/毫升）分别添加400铝的缓冲和孵育2小时，这在25-C。其次是每个样品50铝的添加450铝16毫米醋酸缓冲液，pH值4.8，然后就在室温下的30分钟。活动测定随后在平时进行的方式。2.10。 聚集的测量通过测量聚集的程度在415nm处的浊度为28早些时候报道［30］。蛋白质溶液（0.1毫克/毫升的16毫米醋酸钠）是在理想的温度下孵育。增加吸光度（明显的）对时间作图使用岛津（uv-160）分光光度计。2.11。 测定脱酰胺期间thermoinactivation氨的生产遗传算法是由孵化样品的测定在16mM醋酸钠缓冲液和不同的酶pH值在密封管中，在15分钟70-C管冷却后，打开，溶出量以谷氨酸酶法测定氨脱氢酶［27,31］。3。结果与讨论这是一个公认的事实，蛋白质序列的最终确定其分配的功能。为此，的信息该大分子的三维结构为了明确地确定具体的每个贡献的组成部分的功能性作为一个整体。几个角色已建议的糖蛋白的碳水化合物部分其中蛋白质构象稳定［15］，从蛋白水解［3,5］参与细胞-细胞保护的相互作用和蛋白质折叠［32］是几个例子。然而，这些角色没有一贯表现出所有的糖蛋白。尽管许多努力朝向糖蛋白的碳水化合物的作用的阐明，糖基化的稳定机理是不完全的明确的。在本研究中，遗传算法采用alphamannosidase提供一种制备的去糖基化是有关一些原生的形式比较结构-函数的性质3.1。本地和去糖基化的遗传结构和功能在Vmax无明显变化，公里，活化能（EA）和本地的最适pH和去糖基化的遗传算法（表1）。这些结果表明，去糖基化不影响活性位点也没有催化机理。此外，没有检测到的差异在远紫外CD光谱的两种形式被发现（图2），从而表明的二级结构蛋白质是维持对糖分子的损失。这也从一个不同的遗传观察源的比一个用于研究［19］。圆二色光谱（远紫外）的土著和遗传算法与endo-b-n-acetylglucosaminidase碳水化合物耗尽被认为是相同的［19］。另一种方法在本次调查涉及固有荧光的研究。正如图3所示，观察后，去糖基化的荧光增强。这将导致在一个不同的模式的构象在蛋白质结构中的变化相对于去糖基化，随后的微环境的改变兴奋的色氨酸残基，所支持的一个在荧光强度明显变化（图3）。的表1动力学参数，斯特恩Volmer常数和氨生产-本地和去糖基化的遗传算法PlLoptim)J，maxKsvAjiunonia^GA4812±0.l10+0.20.04140.023520+1.5Deglycosylated4.81.1+0.29.7+0.30.03970.024826±Z5GA(ing-inl)and匕心(i-Ljnol.-'tiiin)weredeterminedatusingdifferentcolieentratiotisofstarchin16mMacetatesodiuni、pH4.8,byperformingtheassaysatleastintriplicates.andareinniorLandkcalmol-1,respectively一Forfurtherdetails,p]eases,eeMaterialsandmethods一apinol/Lin70°C(10min}200001000001-10000-20000-30000 Wavelength(nm)荧光淬灭实验Fag.2.Far-GVspectraofnativeaiiddeg］y<x)sylaredibrnisofglucoaniyl渺之Fordetails,pleaseseeMaLeriJsandme由ods_荧光淬灭实验结果让我们不同类型的评估相对的溶剂接触荧光基团。更暴露的荧光团，越有效的碰撞猝灭剂将在减少荧光强度显示该分子［27,33,34］。斯特恩-沃尔默情节淬火内在蛋白在pH4.5时，制备丙烯酰胺的荧光和的Ksv值进行了测定(表1)。这些数据表明，芳香族氨基酸暴露于相同程度的本地和去糖基化形式。3.2。上的不可逆的去糖基化的影响thermoinactivation清楚地了解运行的稳定性构成今天酶技术的一个重要目标。自温度是一个重要的物理变量enzymecatalyzed反应的努力，旨在阐明在他们的稳定的酶的结构稳定性的关系已主要集中在热稳定性。这是尤其是如GA的酶，其潜在应用是依赖于它的热稳定性。热本机和去糖基化形式的酶的稳定性确定在70-C和三个不同的pH值如图所示。4。正如所指出的，本机的结构是显然更稳定，比去糖基化形式确认碳水化合物部分的作用，在热稳定的蛋白质的结构。降低后的热稳定性也很明显，在其他温度下除去碳水化合物（60-65-75-80-C，结果未示出）。蛋白质展开可逆和不可逆的，表示为：N$U！我其中N是原生形式的蛋白质，U和I可逆和不可逆的展现形式，分别［31,42,46］。我来自修改通过事件的U比如聚合，共价修饰，肽键水解和自动氧化［31,34-37］。有许多在文献中去糖基化有明显的例子改变的反应UYI［38-40］。根霉遗传雪白被发现是热稳定的时去糖基化［19］，也观察到的遗传算法中使用的本研究中。这是示出由这些蛋白质尽管的事实，碳水化合物部分Olinked从黑曲霉和GA在N-连接雪白根霉的酶，这两种蛋白是显着不同，它们的氨基酸碳水化合物组成［41］。去除碳水化合物从人肝AL-岩藻糖苷酶没有影响其催化活动，其总的构象［20］。3.2.1。聚合大幅提高的聚集程度在pH为3.0和4.8（图5），去糖基化后观察到。这是符合改善表面的疏水性

蛋白质结构所建议的增强~ig.3.IiiLriEisicfluoresceiu?eofnstive(N)anildeglycosyialed(D)?ucoamylase-DetailsaredescribedinMaterialsaEidineduxis.Time(min)Fig-4.Irre%ersibieLliernioinacLivaticn 同订就$诵deglycosyiatedfonnsofgJticoatnyiasest70n蛋白质结构所建议的增强~ig.3.IiiLriEisicfluoresceiu?eofnstive(N)anildeglycosyialed(D)?ucoamylase-DetailsaredescribedinMaterialsaEidineduxis.Time(min)Fig-4.Irre%ersibieLliernioinacLivaticn 同订就$诵deglycosyiatedfonnsofgJticoatnyiasest70nC:Native(f专t〔■Ldeg5ycosy]aied*pH4.S;hl一-二；“：亳lycogylaredfA)aipll8一FurtherdccailsaredescribedtinderMaterialsandmethods..mce格ted(o)藻pH3;nativer^o-ozk-'s. . .. 6000 1 1 1 300 325 350 375 400Wavelength(nm)ANS荧光(图6)和亲和力的增加,64ANS荧光(图6)和亲和力的增加,64O.80.Time(sec)Fig-5.AggregaEiociofcisrheanddeg^ycosySatedfbrtiisofglucoain^^ase解70n<?:Native［,kdegly^osyihted(0)atpH3;native(Mldeglyci^sylaied(□)hlpH4.8;iiatave〔▲).deglycosylaced(Ajatpll8.ForftintierdelaH^pleaseseeMaterialsacdmethods.■ 去糖基化与疏水性矩阵形式的互动。ANS是基本上非荧光在水溶液中，而在疏水性，其荧光增加环境。原酶的聚集程度较低所预期的亲水性的存在提供排斥作用的糖成分，失去这可能会导致聚合(图5)。之其他原因增强聚集到一个更高的相关比例的0-折叠片结构的淀粉结合站点［10］。有人曾建议中的测试结构糖蛋白表现出很高的聚集倾向去糖基化后，他们将会更暴露表面［42］。这些观察结果，并结合糖分子的事实，上面的丰富的蛋白质分子的疏水区，提供更高的聚合观察的原因400 500 600Wavelength(nm>Fig.6.ANSFluorescenceoftiative(N)anddegiyaisylated(D)fbniisofglticcati些】asE-Deiai扫aredescribedinMaEeriaJsandineLhods.在碱性pH下的聚集可能被解释方面的由于一个显着性差异的排斥作用进行实验时的pH值之间的满分的蛋白质，等电点(3.5-3.7)，包括那些带负电荷的天冬氨酸残基的贡献的［43,44］。因此，氯化镁，氯化钙列入不同的浓度，发现以增强此处理(数据未显示)。这些观察清楚建立，聚集的重要机制不可逆转thermoinactivation，可能确实可以被期待发生更广泛的去糖基酶的过程中thermoinactivation。有许多文献报道切合增强的去糖基化时的聚集。例如，从黑曲霉(Aspergillusniger)的葡糖氧化酶酵母转化不可溶性，更容易产生去糖基化后聚集［39］。另外，糖基化已经显示出改善的溶解度，折叠或部分折叠的转化酵母的分子，导致抑制聚集［45］。许多重组版本的人类蛋白质，包括a-抗胰蛋白酶(a-AT)进行汇总后存储。这是由于重组蛋白的结构缺乏碳水化合物［46,47］。3.2.2。脱酰胺作用谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺是一种重要的事件可能涉及的蛋白质［48］thermoinactivation这是依赖于pH值［49］。结果示于表1表明在这两种形式中没有显着性差异。这是可以预料的，因为它已被报道天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺增强，如果这些残留物

之前或之后，用Ser或Thr残基在被放置蛋白质的结构［50］。在去糖基化的过程中，糖分子释放丝氨酸或苏氨酸的GA。BABA567 8pH4,83.03.04.83.0图7。ASP-X键裂解机（1Y6）和去糖基化（7Y12）形式的葡糖淀粉酶（0.1毫克/毫升）在pH为3,4.8和8（如上图中），前（B）和（A）70-C加热10分钟后。混合含有醋酸，上限及三，每个浓度在40毫米和缓冲使用的三个pH值调整。的SDS样品的时间是以通常的方式进行的。然而，在这种酶的天冬酰胺或谷氨酰胺残基是没有发现相邻的苏氨酸或丝氨酸。3.2.3。ASP-X键的裂解天冬氨酸-X键被称为是非常不稳定的，在升高的温度［51］。因此，这些债券可裂解在蛋白质的另一个原因thermoinactivation分子［49,51］。正如所指出的（图7），治疗两种形式的GA结果分手的结构，显着的去糖基化比原生的形式，符合此前的酶报道［例如，37］。这些结果并不意外由于ASP是大量发现GA和主要在蛋白质表面［10,37］。此外，损失的糖分子，可能会发生与随之而来的损失的若干重要结构之间的氢键糖分子本身或糖分子和蛋白质的主链结构，从而导致提高了灵活性。3.3。 pH稳定性本土和去糖基化形式的GA去糖基化的形式清楚地显示出更高的稳定性在碱性条件下(图8)。因此，当原始形式失去了几乎所有的活动，大约有一半在pH=12去糖基化蛋白的回收活动。3.4。 的的不可逆thermoinactivation和效果的多元醇不可逆thermoinactivation和原生聚集和遗传算法在存在20%的去糖基化形式的(w/v)甘露糖和海藻糖是描绘在图。9和10。如图所示，这些多元醇两个提供保护形式，大概是被优先排除蛋白质表面［52］。山梨醇表现类似。它有

有人建议，这些添加剂可加强疏水性非极性的氨基酸残基之间