分离分析法导论

分离分析法导论第1页，课件共41页，创作于2023年2月一、色谱分析法及其基本概念1、色谱法的发展1906年，俄植物学家M.Tswett分离植物色素植物叶的色素组成叶绿素a（蓝绿色）叶绿素b（黄绿色）胡萝卜素（橙色）叶黄素（黄色）第2页，课件共41页，创作于2023年2月第3页，课件共41页，创作于2023年2月DevelopingofChromatographicTechnique1948,8daysseparationfor16aminoacids第4页，课件共41页，创作于2023年2月DevelopingofChromatographicTechnique1958,22hoursseparationfor19ofaminoacids第5页，课件共41页，创作于2023年2月DevelopingofChromatographicTechnique1982,lessthan30minutesseparationfor18ofaminoacids第6页，课件共41页，创作于2023年2月2、色谱法分类（1）按流动相和固定相所处状态分气相色谱（GC）气液色谱（固定相为固定液，即固定相是附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体）气固色谱（固定相是固体吸附剂）液相色谱（LC）液液色谱液固色谱（2）按固定相的固定方式分柱色谱（固定相装于柱内的色谱法）纸色谱（固定相是滤纸上的水分，呈平板状）薄层色谱（固定相是吸附剂粉末制成的薄层，呈平板状）第7页，课件共41页，创作于2023年2月（3）按分离原理分吸附色谱（利用组分在固定相上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法）分配色谱（利用组分在（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法）离子交换色谱（利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法）排阻色谱（利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，又称凝胶色谱法）第8页，课件共41页，创作于2023年2月3、色谱图及常用术语（1）色谱图：试样各组分经色谱分离后，从柱后流出进入检测器，检测器将各组分浓度（或质量）的变化转换为电信号（电压或电流），再由记录仪记录下来，所得的电信号强度随时间变化的曲线，即为流出曲线，也称为色谱图，曲线上突起部分就是色谱峰。第9页，课件共41页，创作于2023年2月（2）常用术语①基线：柱中只有流动相流过时，检测器的响应信号记录值，稳定的直线应是一条水平直线。②峰高h：色谱峰顶点与基线的垂直距离峰宽：峰底宽Y

半峰宽：1/2h处的峰宽，Y1/2

标准偏差：0.607h处的峰宽为2

峰面积：第10页，课件共41页，创作于2023年2月③保留值：表示试样中各组分在色谱柱内停留状况的指标，反映组分分子与固定相分子间作用力的大小，通常用时间和流动相的体积表示。用体积表示的保留值（单位：mL）死体积（V0）：不被固定相保留的组分，通过色谱柱所消耗的流动相体积，由死时间确定保留体积（VR）：试样从进样到出现最大峰所通过的流动相体积调整保留体积（VR’）：VR’=VR-V0用时间表示的保留值（单位：min，s等）死时间（t0）：不被固定相保留的组分，从进样到出现最大峰所需的时间，也即流动相流经色谱柱所需的时间保留时间（tR）：试样从进样到出现最大峰所需的时间调整保留时间（tR’）：tR’=tR-t0相对保留值（2,1）：也称选择性因子，为两组分的调整保留值之比一般选择tR2’大于tR1’，所以值大于1，越大，分离效果越好。第11页，课件共41页，创作于2023年2月色谱峰的个数——判断组分的个数色谱峰的保留值——定性分析色谱峰的面积或峰高——定量分析相对保留值——固定相与流动相的选择是否合适保留值、区域宽度——评价色谱柱分离效能的好坏色谱图

信息第12页，课件共41页，创作于2023年2月（3）分配平衡样品组分在固定相与流动相之间进行多次分配使其得到分离。第13页，课件共41页，创作于2023年2月样品在固定相与流动相之间进行分配，很快达到平衡，即分配平衡。当流动相流过时，样品将在流动相和新的固定相中又达到分配平衡，同时原来仍在固定相中的样品与新的流动相之间也会形成新的分配平衡，随着流动相的不断流过，它们携带发生分配平衡后仍存在于流动相中的样品沿着柱子向前流动，从而达到不同组分分离的目的。色谱分离原理及分离参数分配系数（组分在固定相中的浓度）（组分在流动相中的浓度）分配比（组分在固定相中物质的量）（组分在流动相中物质的量）第14页，课件共41页，创作于2023年2月分配比影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质；温度和压力等因素；流动相及固定相的体积。分配系数影响因素：组分、流动相和固定相的热力学性质；温度和压力等因素。（组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此分配比又称分配容量或容量因子）第15页，课件共41页，创作于2023年2月A,B组分未分离A,B组分分离不完全A,B组分分离完全二、色谱分析法基本理论两组分的分配系数有差异区域扩散速率小于区域分离速率受哪些因素影响？塔板理论速率理论第16页，课件共41页，创作于2023年2月1、塔板理论结论：n与半峰宽及峰底宽的关系n大于50，可得到峰形基本对称的曲线只要被分离组分K有差异，只要n足够大，经过反复多次的分配后均可进行分离假设：（1）色谱由一系列连续的，相等的水平塔板组成，每一塔板高度为H，理论塔板数n=L/H（2）在每一塔板内，组分可在两相间迅速达到平衡（3）流动相进入是间歇的，而非连续，每次进入为一个塔板体积（4）所有组分开始存在于0号塔板上，而且试样沿纵向扩散不计（5）分配系数K恒定不变第17页，课件共41页，创作于2023年2月理论优点：解释了流出曲线的形状，提出了计算和评价柱效能高低的因素（n

）如果若tR一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱效能越高。理论缺点：（1）色谱过纵向扩散等不能忽略，（2）塔板理论只能定性地给出板高的概念，不能解释板高受哪些因素影响，无法提出降低塔板高度的方法（3）不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数（4）分配系数与浓度无关只能在有限的浓度范围内成立（5）色谱柱中没有真正的平衡体系第18页，课件共41页，创作于2023年2月2、速率理论1956年，荷兰，范弟姆特，速率理论A：涡流扩散项系数，B：分子扩散项系数，C：传质项系数，u：平均流速A，B，C越小，H越小，n越大，柱效高A，B，C越大，H越大，n越小，柱效低第19页，课件共41页，创作于2023年2月A-涡流扩散项由于流动相流经填充物的不规则空隙时，其流动方向改变，形成紊乱的类似“涡流”的流动而引起涡流扩散过程示意图影响因素：：填充不规则因子；dp：填充物平均直径结论

dp越小（采用小颗粒填充物），越小（颗粒均匀），A就越小，空心毛细管柱A＝0第20页，课件共41页，创作于2023年2月第21页，课件共41页，创作于2023年2月B/u-分子扩散项（纵向扩散项）样品在纵向上的浓度梯度而造成的扩散（a）柱内组分扩散（b）相应的响应信号影响因素：：弯曲因子。填充柱中由于固定相颗粒的存在，使分子自由扩散受到阻碍，扩散程度降低，<1；空心毛细管柱=1。

Dg：组分分子在其气相中的扩散系数。组分分子量大，柱温高，柱压大，载气分子量大，Dg小；反之则大。

u：流动相平均线速，纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。结论：采用分子量较大的载气，较高的载气流速，控制较低的温度，可使分子扩散项系数减小第22页，课件共41页，创作于2023年2月第23页，课件共41页，创作于2023年2月Cū-传质阻力项物质迁移过程中存在的阻力第24页，课件共41页，创作于2023年2月Cm：流动相传质阻力项系数，即为待测试样组分从流动相移动到固定相表面的进行分配时所受到的阻力影响因素：容量因子k’

，填充物平均直径dp，组分在气相中的扩散系数Dg

结论：采用颗粒小的填充物，及分子量小的载气Cs：固定相传质阻力项系数，组分分子由流动相进入固定相内部，达到分配平衡，又回到界面，再溢出界面，被流动相带走这一过程受到的阻力影响因素：容量因子k’

，固定液液膜厚度df

，组分在固定相中的扩散系数Ds

结论：降低液膜厚度第25页，课件共41页，创作于2023年2月范氏方程总的影响因素：填充物的均匀程度，填充物粒度的大小，流动相的种类和线速，固定相的液膜厚度第26页，课件共41页，创作于2023年2月柱效：色谱分离的动力学因素，由理论塔板数来衡量。如果若tR一定，那么n越大，H越小，则色谱峰越窄，柱效能越高。选择性：两峰间的距离衡量色谱的选择性，距离越大选择性越好，一般以表示3、色谱分离效能的衡量(a)两组分没有完全分离(b)两组分完全分离，但柱效不高(c)两组分分离不完全，但柱效较好(d)两组分分离完全，且柱效很好第27页，课件共41页，创作于2023年2月分离度分离度概念：又叫分辨率或分辨度，色谱峰中相邻两峰分离程度的量度，是相邻两峰保留值之差与两峰峰底宽的平均值之比。R值越大，表明相邻两组分分离越好Rs<1，两峰部分重叠Rs=1，两峰刚好分离(分离程度可达98%)Rs>1.5，两峰完全分离(分离程度可达99.7%)分离度基本方程式：第28页，课件共41页，创作于2023年2月

n越大，R越大——n=L/H，(R1/R2)2=n1/n2=L1/L2

增加柱长的色谱柱可以提高分离度，但延长了分析时间。制备一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。（1）分离度与柱效的关系（3）分离度与相对保留值的关系

r2,1=1时，R=0，不能使两组分分离。r2,1>1才可进行分离。r2,1大，选择性好。r2,1的微小变化，就能引起分离度的显著变化。改变固定相和流动相的性质、组成或降低柱温，可有效增大r2,1值。

k增大可使R增大，当k>10时，k/k＋1改变不大，R增长是不大，一般取k为1~10最宜。改变柱温和相比，可以改变k。（2）分离度与分配比的关系第29页，课件共41页，创作于2023年2月已知物质A和B在一根30.00cm长的柱上的保留时间分别为16.40min和17.63min。不被保留组分通过该柱的时间为1.30min。峰底宽度分别为1.11min和1.21min，计算：（1）柱的分离度；（2）柱的平均塔板数；（3）达到1.5分离度所需的柱长度。解：（1）柱的分离度

R=2（17.63-16.40）/（1.11+1.21）=1.06

（2）柱的平均塔板数

n=16(16.40/1.11)2=3493n=16(17.63/1.21)2

=3397n平均

=（3493+3397）/2=3445

（3）达到1.5分离度所需的柱长度

R1/R2=(n1/n2)1/2

n2=3445(1.5/1.06)2=6898L=nH=6898(300/3445)=60cm第30页，课件共41页，创作于2023年2月三、色谱的定性分析和定量分析与标样对照的方法保留值法（单柱法和双柱法）相对保留值法已知物的峰高加入法1、色谱定性方法利用保留指数法定性方法：分别测出待测物质i与基准物质s的调整保留值，求出相对保留值ris，将ris与文献值比较后定性。基准物质通常选容易得到纯品的，且与被分析组分相近的物质，如正丁（戊）烷、环己烷（醇、酮）、苯、对二甲苯等。

优点：ris仅随固定液及柱温变化，与其它操作条件无关。方法：首先作出未知物样品的色谱图，然后在未知物样品中加入某已知物，又得一色谱图，峰高增加的组分即可能为这种组分。优点：当未知样品中组分较多，所得色谱峰过密，用上述方法不易辨认时，或仅作未知样品指定项目分析时均可用此法。第31页，课件共41页，创作于2023年2月

例：确定物质i在某固定液X上的保留指数IiX

的数值。tR(Z+1)

内插法求IiX示意图信号

tR(Z)

tR(i)

t进样保留指数定性法（柯瓦指数）方法步骤：（1）规定正构烷烃的保留指数为其碳原子数乘以100，如正戊烷，正己烷、正庚烷的保留值分别为500，600和700（2）z，z+1为正构烷烃的碳数，测得碳数为z，z+1以及样品i的调整保留时间分别为tR(z)’，tR(z+1)’，tR(i)’，且tR(z)’<tR(i)’<tR(z+1)’，求Ix

’。（3）由求出的Ix

’值查阅文献，推测未知物。优点：保留指数计算准确，准确度高，值仅与柱温和固定相有关第32页，课件共41页，创作于2023年2月利用质谱定性试样试样

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCD气相色谱质谱分离鉴定BACD第33页，课件共41页，创作于2023年2月基本原理：质谱分析是将样品转化为运动的带电气态离子碎片，于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方法。分子离子碎片离子重排裂解碰撞裂解第34页，课件共41页，创作于2023年2月第35页，课件共41页，创作于2023年2月2、色谱定量分析定量分析基础：待测组分的质量或浓度与色谱峰的峰面积或峰高成正比定量分析步骤：准确测量检测器的响应信号—峰面积或峰高；峰高乘以半峰宽法A=1.065hY1/2

峰高乘以平均峰宽法A=1/2h(Y0.15+Y0.85)

剪纸称重法自动积分法准确求得比例常数—校正因子；正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为组分的百分含量。第36页，课件共41页，创作于2023年2月（1）校正因子绝对校正因子相对校正因子：组分i与标准物质s的绝对校正因子之比。fi

值由文献中得，