微生物学实验课件

微生物学实验实验一微生物学实验基础普通光学显微镜的使用培养基的制备消毒与灭菌细菌三型的观察普通光学显微镜的使用目的要求1.学习并掌握油镜的原理及使用方法2.复习普通台式显微镜的结构、各部分的结构、使用方法基本原理（油镜的原理）1.增加照明亮度在油镜与载玻片间加折射率与玻璃相近的介质（如：香柏油）减少光线的折射与反射损失2.增加显微镜的分辨率油镜的使用方法1.准备工作（复习）显微镜的放置光源的调节目镜的调节聚光器的调节油镜的使用方法2.显微观察低倍镜观察高倍镜观察油镜观察在观察目标区域滴加香柏油，仔细微调，认真观察寻找观察目标油镜的使用方法3.显微镜使用完毕的处理上升镜筒，取下载玻片用擦镜纸檫去油用擦镜纸蘸无水乙醚乙醇用干净擦镜纸擦拭物镜与目镜还原各部分注意：切勿用手、其他纸擦拭镜头实验观察内容及实验报告内容：观察金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的染色标本试验报告：绘出金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在油镜下的形态。链球菌杆菌培养基的制备牛肉膏蛋白胨培养基的制备目的要求1.明确培养基的制备原理2.掌握配置培养基的一般方法与步骤培养基的制备原理牛肉膏蛋白胨培养基是应用最广泛的、最普通的细菌培养基,也称普通培养基组成牛肉膏：碳源、能源、磷酸盐、维生素蛋白胨：氮源、维生素NaCl:无机盐水琼脂：塑型培养基的制备方法1.称量(牛肉膏,蛋白胨,NaCl)2.溶化3.调pH4.过滤5.分装6.加塞7.包扎8.灭菌9.搁置斜面注意事项1.蛋白胨易吸水，称取要迅速2.琼脂溶化过程中注意温度，勿使过热溢出消毒与灭菌消毒与灭菌的概念消毒：一般是指消灭病原菌与有害微生物的营养体灭菌：指杀灭一切微生物的营养体、芽孢、孢子消毒与灭菌的主要方法加热法过滤法照射法化学药品加热法干热灭菌火焰灼烧灭菌：接种环、接种针、金属用具、无菌操作时在火焰上短暂灼烧瓶口等热空气灭菌：玻璃器皿加热法－－湿热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅15-30min培养基、工作服、橡皮物品、玻璃器皿等常压蒸汽灭菌某些不适宜高压蒸汽灭菌的培养基不具备高压蒸汽灭菌条件的仅能杀死大多数微生物、可用常压间歇灭菌法加热法－－湿热灭菌煮沸消毒法注射器、解剖器械等10-15min可杀死细菌所有营养体、部分芽孢超高温杀菌135-150℃、2-8s牛奶及其他液态食品杀死微生物、保存营养其他方法过滤除菌血清、抗生素、糖溶液等不适宜加热消毒灭菌辐射灭菌紫外线照射化学药品灭菌重金属离子、抗生素、来苏尔、７５％的乙醇。干热灭菌目的要求：１.了解干热灭菌的原理和应用范围２.学习干热灭菌的操作技术基本原理：干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固与其本身的含水量有关，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之，含水量越小，凝固缓慢。因此与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（１６０～１７０℃），时间长。干热灭菌器材：培养皿，试管，吸管，电烘箱等操作步骤：装入待灭菌的物品：避免物品太挤妨碍空气流通升温恒温降温开箱取物：温度未降至70℃前勿开箱，防爆高压蒸汽灭菌一、目的要求：１.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。２.学习高压蒸汽灭菌的基本方法。二、基本原理高压使水的沸点增高，产生超过100℃的高温蒸汽，导致菌体蛋白质凝固变性水蒸气的穿透性强湿热的蒸汽有潜热高压蒸汽灭菌器材：牛肉膏蛋白胨培养基、培养皿、高压蒸汽灭菌锅操作步骤取出内层锅，向外层锅内加适量的水放置内层锅及待灭菌物加盖，并将盖上排气软管插入内层锅的排气槽加热同时打开排气阀灭菌所需时间到后关闭电源，降温取出灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，检查无菌生长则可用试验报告检查灭菌是否彻底紫外线灭菌一、目的要求：了解紫外线灭菌的基本原理及方法二、基本原理紫外线可诱导胸腺嘧啶二聚体的形成、DNA链的交联，抑制DNA的复制幅射使空气中的氧电离产生[o],使o2生成臭氧（O3）或使H2O生成H2O2,利用O3H2O2的氧化杀菌作用紫外线灭菌器材：牛肉膏蛋白胨培养基、溶液或试剂、紫外线灯操作步骤紫外线灯直接照射30min、检查培养基37℃温箱培养24小时，无菌生长则可用化学消毒剂与紫外线照射结合使用试验报告检查灭菌是否彻底微孔滤膜过滤除菌一、目的要求：１.了解过滤除菌的基本原理。２.掌握过滤除菌方法。二、基本原理通过机械作用滤去液体或空气中的细菌微孔滤膜过滤除菌器材培养基、2%葡萄糖溶液、肉汤蛋白胨平板注射器、微孔滤膜过滤器、0.22um滤膜、无菌试管、镊子、玻璃刮棒操作步骤组装滤膜、灭菌连接压滤无菌检查清洗试验报告记录无菌检查结果实验二微生物的染色与形态结构的观察主要内容细菌的简单染色法革兰氏染色法细菌的芽孢染色法荚膜染色法细菌的简单染色法一、目的要求：１.学习微生物的涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。２.初步认识细菌的形态特征。

3.巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。二、基本原理常用碱性染料：美蓝、结晶紫、碱性复红等在中性、碱性、弱酸性环境中细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离时其分子的染色部分带正电荷，染料易使细菌着色。细菌的简单染色法器材菌种：枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物染色剂：吕氏碱性美蓝染液、齐氏石炭酸复红染液操作步骤涂片：载玻片中央滴加一滴生理盐水，接种环无菌操作挑少许菌苔涂成薄膜干燥：室温自然干燥固定：热固定载玻片涂面朝上通过火焰2-3次染色：载玻片平放，滴加染液覆盖薄膜，染约1min水洗：用自来水轻轻的从玻片一端直接冲去染液干燥镜检试验报告根据观察结果绘出细菌形态图革兰氏染色法一、目的要求：１.学习并初步掌握革兰氏染色法。２.了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理1884年丹麦病理学家ChristainGram创立。基本组成为结晶紫、碘液、酒精、复红。细胞保持蓝紫色为革兰氏阳性菌，成红色为革兰氏阴性菌。染色性与细菌细胞壁的组成和结构有关。革兰氏染色法器材菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、蜡样芽孢杆菌12-20h营养琼脂斜面培养物。染色剂：革兰氏染液操作步骤制片：常规涂片、干燥、固定初染：滴加结晶紫染色1-2min，水洗媒染：用碘液冲去残水，加碘液覆盖染1min，水洗脱色：滤纸吸去残水，95%乙醇脱色，水洗复染：用复红液染2min干燥镜检试验报告根据观察结果说明细菌的形状、颜色、及革兰氏染色反应细菌的芽孢染色法一、目的要求：１.学习并掌握芽孢染色法。２.初步了解芽孢杆菌的形态。二、基本原理芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，其特征是鉴定细菌的依据之一。用着色能力强的染液（如：孔雀绿、石炭酸复红）在加热情况下透过菌体进入芽孢使其着色，通过水洗菌体的颜色被洗掉，芽孢的染色则被保留，从而区分菌体与芽孢。细菌的芽孢染色法器材菌种：蜡样芽孢杆菌2d营养琼脂斜面培养物、球形芽孢杆菌1-2d营养琼脂斜面培养物。染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液操作步骤（Schaeffer-Fulton氏染色法）制片：常规涂片、干燥、固定染色：滴加数滴孔雀绿染液，火焰上加热至染料冒蒸汽时开始记时染5min，水洗复染：用番红液复染2min，水洗干燥镜检试验报告根据观察结果绘出芽孢杆菌的形态特征荚膜染色法一、目的要求：学习并掌握荚膜染色法。二、基本原理荚膜是包围在细菌细胞外的一层黏液状或胶质状物质，主要成分为多糖、糖蛋白或多肽。荚膜与染液亲和力低、不易着色，且可溶于水，通过水洗可在菌体的周围形成一透明圈。荚膜染色法器材菌种：褐球固氮菌约2d无氮琼脂斜面培养物。染色剂：绘图墨水、1%甲基紫水溶液、1%结晶紫水溶液、6%葡萄糖水溶液、20%硫酸铜水溶液操作步骤湿墨水法制备菌和墨水混合液加盖玻片镜检（低、高倍镜）结果：灰色背景下在菌体周围呈现明亮的透明圈既为荚膜荚膜染色法操作步骤干墨水法制备混合液：6%葡萄糖液、菌体、墨水制片：涂片—干燥—热固定染色：1%甲基紫染1-2min,水洗镜检（低、高倍镜）结果：灰色背景，菌体紫色，菌体周围的清晰透明圈既为荚膜荚膜染色法操作步骤Anthony氏法制片：涂片—自然干燥染色：1%结晶紫染2min脱色：用20%硫酸铜水溶液冲洗镜检（油镜）结果：菌体深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色实验三细菌形态观察放线菌形态的观察霉菌形态的观察放线菌形态的观察一、目的要求：１.学习并掌握观察放线菌形态的基本方法。２.初步了解放线菌的形态特征。二、基本原理放线菌是能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性菌，在培养基中生长的称基内菌丝；向空气中生长的称气生菌丝能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是鉴定放线菌的重要依据。放线菌形态的观察器材菌种：细黄链霉菌培养基：灭菌的高氏Ｉ号琼脂染色剂：石炭酸复红染液操作步骤扦片法倒平板灭菌的高氏Ｉ号琼脂接种扦片培养盖玻片镜检（低、高倍镜）结果：放线菌形态的观察操作步骤玻璃纸法倒平板灭菌的高氏Ｉ号琼脂接种扦片培养盖玻片镜检（低、高倍镜）结果：放线菌形态的观察操作步骤印片法倒平板灭菌的高氏Ｉ号琼脂接种培养印片染色石炭酸复红染液1min，水洗镜检（油镜）结果：霉菌形态的观察一、目的要求：１.学习并掌握观察霉菌形态的基本方法。２.了解四类常见霉菌的基本形态特征。二、基本原理霉菌能形成复什分枝的菌，有基内菌丝和气生菌丝，后者生长到一定程度分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子菌丝体或孢子的形态特征是鉴定霉菌的重要依据。霉菌形态的观察器材菌种：曲霉、青霉培养2-5d的马铃薯琼脂平板培养物培养基：土豆琼脂染色剂：乳酸石炭酸棉蓝染液仪器和其他用具：无菌吸管、平皿、载玻片、盖玻片、U形玻棒、解剖针、解剖刀、镊子、50％乙醇、20％甘油等霉菌形态的观察操作步骤（直接制片观察法）在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产生孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇中浸一下洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。加盖玻片，用低倍镜观察，必要时换高倍镜。试验报告：绘图说明霉菌的形态特征微生物的分离与纯化一、目的要求：掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。二、基本原理微生物的分离与纯化指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程常用方法：简易单细胞挑取法平板分离法微生物的分离与纯化平板分离法基本原理选择性培养：选择适合于待分离微生物的生长条件（营养、酸碱度、温度、氧等）要求或加入某种抑制剂造成只适合于该微生物的生长，抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些微生物单个菌落平板划线法：微生物在固体培养基上可形成单个菌落，挑取该菌落在琼脂平板上划线培养可纯化细菌微生物的分离与纯化器材菌种：米曲霉培养基：淀粉琼脂、牛肉膏蛋白胨琼脂马丁氏琼脂培养基、查氏琼脂培养基溶液和试剂：10％酚盛9ml无菌水的玻璃试管、盛90ml无菌水并带玻璃珠的三角烧瓶、4％水琼脂仪器和其他用具：无菌玻棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、链霉素、土样等微生物的分离与纯化操作步骤稀释涂布平板法平板划线分离法简易单孢子分离法实验报告酵母菌形态的观察

及死活细胞的鉴别一、目的要求：１.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活的实验方法。２.掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。二、基本原理

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，比长见的细菌大十倍左右，大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖。美蓝的氧化型为蓝色，还原型为无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，美蓝由蓝色的氧化型还原成无色的还原型，借此可鉴别酵母细胞的死活。酵母菌形态的观察

及死活细胞的鉴别器材菌种：酿酒酵母培养约2d的麦芽汁斜面培养