荧光探针和分子传感器

荧光探针和分子传感器200507051第1页，课件共65页，创作于2023年2月郭祥群博士，博士生导师全国高校化学教育研究中心第四届学术委员会副主任，教育部高等学校本科教学工作水平评估专家，中国化学会理事先后获得国家级奖2项，省部级奖4项，发表科研与教学研究论文100余篇。研究兴趣：荧光光谱分析的原理与技术，在研项目涉及生物活性自由基的荧光表征，海洋污染生物监测技术研究，食品安全等。联系方式:xqguoL),2187288(O),2182355(H)200507052第2页，课件共65页，创作于2023年2月FluorescentProbesIntroductionFluorescentSensor

荧光传感FluorescentTracer荧光示踪

FRET

共振能量转移荧光Application

1.Radicalprobes2.Ionprobes3.NIRFFluorescenceimage4.DNAsequence5.Proteinprobes6.DNAprobes7.Membraneprobes8.pHprobes200507053第3页，课件共65页，创作于2023年2月ThankyouThankyou

200507054第4页，课件共65页，创作于2023年2月FluorescenceresearchKeyword:Fluorescen*Period:Jan/2005-Jun/2005Database:

美国化学会(ACS)数据库3566篇WPS电子期刊全文数据库206篇SDOS全文数据库（上交镜像）1890篇英国皇家化学会（RSC)数据库120篇研究与应用领域涉及：生命环境材料等讲座要求了解：荧光探针表征应用研究意义200507055第5页，课件共65页，创作于2023年2月MolecularProbeMolecularreporterFromJ.Fluorescence200507056第6页，课件共65页，创作于2023年2月homepagewww.probes.comMolecularprobes200507057第7页，课件共65页，创作于2023年2月JablonskidiagramT1hAhAAbsorption10-15sVibrational

relax,VR,10-1210-14sInternalconversion,IC,10-1110-13sIntersystemcrossing,ISC,10-210-6sFluorescencePhosphorescenceICISCS0S1S2321010-8s10-3100shFhPHOMOLUMO200507058第8页，课件共65页，创作于2023年2月CharacteristicsofFluorophoreExcitationwavelength激发波长

exEmissionwavelength发射波长

emExtinction(absorption)coefficient吸光系数Stoke’sshiftFluorescencelifetime荧光寿命Fluorescencequantumyield荧光量子产率

FluorescenceAnisotropy各项异性rFluorescencePolarization荧光偏振p200507059第9页，课件共65页，创作于2023年2月Excitationandemissionspectra1ExcitationspectrumEmissionspectraFemFexemex2005070510第10页，课件共65页，创作于2023年2月Fluorescencelifetimerelaxation(10-12s)S0S1S1hvAhvFknrSimplifiedJablonskidiagram

:EmissionrateKnr:nonradiativedecayrateDefinitionAveragelifetime:theaveragetimethemoleculespendsintheexcitedstatepriortoreturntothegroundstate.Expression2005070511第11页，课件共65页，创作于2023年2月FluorescenceQuantumYieldDefinition

ThefluorescencequantumyieldistheratioofthenumberofphotonsemittedtothenumberabsorbedExpression

2005070512第12页，课件共65页，创作于2023年2月Sensor(1)+SRTS信号单元，R识别单元，T靶分子hvhvhv自由基传感Z.-Y.Bian,X.-Q.Guo*,AnalyticalScience,21553-559,20052005070513第13页，课件共65页，创作于2023年2月Sensor(2)DDhue

-hvhvhvPETPhotoinducedElectronTransferhvHg2+E.M.Nolan,etal.,J.Am.Chem.Soc.,2003,125:14270-14271SRT2005070514第14页，课件共65页，创作于2023年2月Sensor(3)RShvhvFRETFD,exD,emA,exA,emFD,exD,emA,exA,emT+hvhv’FluorescenceResonanceEnergyTransfer2005070515第15页，课件共65页，创作于2023年2月ProbingDNAMolecularbeacons分子信标ADQFTargetDNAssDNAbindingproteinDenaturingreagentQFFQ2005070516第16页，课件共65页，创作于2023年2月Sensor(4)+S-RThvhvAl3+hv2005070517第17页，课件共65页，创作于2023年2月Sensor(5)+S-RT+竞争型+S-RT催化剂中间体+hvhv催化型2005070518第18页，课件共65页，创作于2023年2月TheFusionofIntegalMembraneProtein荧光素标记鼠蛋白质罗丹明标记人蛋白质鼠细胞人细胞37°C15°C融合异核体FromInstantnotes,Biochemistry,E2Tracer膜内蛋白侧向运动2005070519第19页，课件共65页，创作于2023年2月CelltracerA30µm–thicksectionofazebrafishembryostainedwithCellTrackerCM-DiI(C7000,C7001)priortoimmunohistochemicalanalysis.Aone-day-oldzebrafishembryowasimmobilizedandimpaledinthehindbrainwithamicroelectrodefilledwith1mg/mLCellTrackerCM-DiIin95%ethanol.Onedaylater,thebrainwasfixed,embedded,frozeninliquidnitrogenandsectionedonacryostat.Afterblockingwith0.1%TritonX-100inPBScontaining2%BSAand2%normalgoatserum,the30µm–thicksectionwasincubatedwithprimaryanti-glialantibodyinconjunctionwithfluoresceingoatanti–mouseIgGantibody.Thissectionwasthenviewedsequentiallythroughopticalfiltersetsappropriateforrhodamineandfluorescein,andtheresultingimagesweresuperimposed.TheimagewascontributedbyWilliamTrevarrow,BeckmanInstitute,CaliforniaInstituteofTechnology.C7000C68H105Cl2N3O荧光染色的斑马鱼胚胎2005070520第20页，课件共65页，创作于2023年2月TracerAgF-AgAb抗体在免疫反应前后荧光探针自身的荧光量子产率不发生变化的情况测反应剩余的标记抗原，荧光正比抗原量测固相荧光，荧光反比抗原量测固相洗脱，荧光反比抗原量F标记抗原待测抗原∆—F∆—F荧光分子F∆∆∆∆—F∆—F∆2005070521第21页，课件共65页，创作于2023年2月FRET

FluorescenceResonanceEnergyTransfer2005070522第22页，课件共65页，创作于2023年2月PrincipleofFRETRateofenergytransferDquantumyieldofDDlifetimeofDr

distancebetweenAandDnrefrcativeindexNAvogadro’snumberk

orientationfactorJ

overlapintegral

FD,exD,emA,exA,em2005070523第23页，课件共65页，创作于2023年2月Orientationfactork=2/3randomizebyrotationaldiffusionpriortoenergytransfer2005070524第24页，课件共65页，创作于2023年2月FRETsensordesignbasedondonorandacceptordistancechangesK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-4132005070525第25页，课件共65页，创作于2023年2月FRETprobingcAMPK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413cAMPcyclicadenosinemonophosphate环腺苷酸环腺苷酸依赖蛋白激酶支架结构四聚体表征cAMP2005070526第26页，课件共65页，创作于2023年2月FRETprobingPDE磷酸二酯酶BeforehydrolysisAfterhydrolysisK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413BeforeAfter香豆素phosphodiesterasehvhvhv2005070527第27页，课件共65页，创作于2023年2月EmissionspectraPDE2005070528第28页，课件共65页，创作于2023年2月FRETsensordesignbasedonmodulationofspectraloverlapFD,exD,emA,exA,emFD,exD,emA,exA,em有利于能量转移不利于能量转移2005070529第29页，课件共65页，创作于2023年2月Probingphosphatase磷酸酶LFabsQFabsDonorEmiLF(内酯）QF(醌型）K.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413PTP蛋白质酪氨酸磷酸酶香豆素荧光素2005070530第30页，课件共65页，创作于2023年2月生物活性自由基研究的重要性•OHO2-•RO•ROO•NO活性氧自由基其他R•GS•为维持生命所必须过量产生会导致生物大分子损伤生命过程中所产生的自由基，是行使生理功能及介导其生化反应所必需的。如在线粒体呼吸链上电子传递过程中产生的自由基在线粒体能量代谢中起着重要的作用。2005070531第31页，课件共65页，创作于2023年2月•OH抽氢导致DNA断裂2005070532第32页，课件共65页，创作于2023年2月硫中心自由基引起细胞损伤2005070533第33页，课件共65页，创作于2023年2月顺磁标记荧光探针-ProbingfreeradicalParamagnetic(Lowfluorescence)Diamagnetic(Highfluorescence)产物抗磁性，稳定自由基之间的反应快速多功能探针：ESR；荧光（强度、偏振、寿命等）荧光显微技术应用于细胞、组织的自由基作用研究2005070534第34页，课件共65页，创作于2023年2月比率型荧光分子-ProbingNOSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2002,2250-2251NO•FRETex=360nmem=470nmem=410nmex=360nm荧胺香豆素2005070535第35页，课件共65页，创作于2023年2月•OH比率型荧光探针-Probing•OHSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2004,496-497以与自由基作用的特征靶分子或官能团作为识别基团荧光素罗丹明脱氧胸腺嘧啶核苷二聚体2005070536第36页，课件共65页，创作于2023年2月Ca2+indicatorFura-2Fura-Ca2+Fura钙具有使原生质胶体稳定以及调节细胞膜的结构和通透性的作用。对各种细胞的兴奋性具有正负效应。ExcitationEmission2005070537第37页，课件共65页，创作于2023年2月Ca2+indicatorIndo-1Indo-1-Ca2+2005070538第38页，课件共65页，创作于2023年2月ICTprinciple2005070539第39页，课件共65页，创作于2023年2月ImageofFura-2-Ca2+False-colorimage（假色成像）offreeCa2+concentrationinaPurkinjeneuron（梨状神经元）fromembryonicmousecerebellum（胚鼠小脑）Thecompositeimage,whichrepresentstheratioofimagesobtainedwithexcitationat340nmand380nm,revealsthemobilizationofinternalCa2+storeswithoutcontributionfromCa2+influx.Fura-2-Ca2+胚鼠小脑梨状神经元中游离Ca2+浓度荧光成像2005070540第40页，课件共65页，创作于2023年2月ImageofspiralCa2+waveFluo-3(F1240)confocalimageofaspiralCa2+waveinitiatedbyinjectionofanonhydrolyzableanalogofinositol1,4,5-triphosphate（肌醇三磷酸非水解模拟物）inaXenopuslaevisoocyte（瓜蟾卵母细胞）.TheimagewascontributedbyDavidClapham,HarvardUniversity,andreproducedwithpermissionfromCell69,283(1992).瓜蟾卵母细胞中螺旋Ca2+波共焦荧光成像Fluo-32005070541第41页，课件共65页，创作于2023年2月Na+indicatorSBFISBFISBFI-Na+海马切片CA1锥形神经元Na+成像2005070542第42页，课件共65页，创作于2023年2月Cd2+indicatorFluorescenceemissionspectraofamixtureof1µMBTC-5N(B-6845)and1µMTCPPinsolutionscontainingzeroto1.0µMCd2+.BTC-5N,tetrapotassiumsalt2005070543第43页，课件共65页，创作于2023年2月Zn2+indicatorAPTRA-BTC,tripotassiumsaltFluorescenceexcitationspectraofAPTRA-BTC(A-6895)insolutionscontainingzeroto25µMZn2+.2005070544第44页，课件共65页，创作于2023年2月pHindicator5-sulfofluoresceindiacetate,sodiumsalt(SFDA)2005070545第45页，课件共65页，创作于2023年2月DNA-basedpHsensorTatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-71302005070546第46页，课件共65页，创作于2023年2月TatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-7130DNA-basedpHindicator表征MCF-7乳腺癌细胞编程性死亡过程ApoptosisMCF-7乳腺癌细胞2005070547第47页，课件共65页，创作于2023年2月荧光成像通过静脉注射或腹腔注射到生物体内的近红外荧光探针吸着并聚集于肿瘤等组织中，肿瘤中存在特异的细胞、蛋白质、酶等，这些物质可与荧光探针结合或反应而发出荧光，可根据荧光的位置、强度得知肿瘤的位置、大小，是否转移、扩散及肿瘤的阴性、阳性等一系列信息.2005070548第48页，课件共65页，创作于2023年2月近红外成像为什么选择近红外？2005070549第49页，课件共65页，创作于2023年2月GFP绿色荧光蛋白Endostatin内生抑制素Cy5.5花菁荧光染料NIR1,NIR2,GFP不同滤光片CY5.5标记的内生抑制素特异识别肿瘤2005070550第50页，课件共65页，创作于2023年2月2005070551第51页，课件共65页，创作于2023年2月2005070552第52页，课件共65页，创作于2023年2月Self-quenchingprobeRalphWissleder,et.al.NatureAmerica1999,17:375-378酶活化酶作用位点C-PGC肿瘤伴生溶酶体蛋白酶特异识别自猝灭荧光探针（或细胞成像）多甲氧基聚乙烯乙二醇-聚赖氨酸-cy5.5(C-PGC),2005070553第53页，课件共65页，创作于2023年2月2005070554第54页，课件共65页，创作于2023年2月Phasecontrastimage相差成像NIRFimage肿瘤细胞成像NIRFNIRFLysosomalcompartment溶酶体分隔2005070555第55页，课件共65页，创作于2023年2月NIRFimage2005070556第56页，课件共65页，创作于2023年2月Template3’CCGGTAGCAACT5’Primer5‘GG3’GGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGGGCCATCGTTGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTdATPdCTPdGTPdTTPddATPdATPdCTPdGTPdTTPddCTPdATPdCTPdGTPdTTPddGTPdATPdCTPdGTPdTTPddTTPF1--AF2--CF3--GF4--TDNApolymerasedATP脱氧腺苷dCTP脱氧胞苷dGTP脱氧鸟苷dTTP脱氧胸苷ddATP双脱氧腺苷ddCTP双脱氧胞苷ddGTP双脱氧鸟苷ddTTP双脱氧胸苷FDNAsequence2005070557第57页，课件共65页，创作于2023年2月近红外成像荧光探针七次甲基花菁素类(图2，a)2005070558第58页，课件共65页，创作于2023年2月Proteinprobes蛋白质荧光探针RG对牛血清白蛋白（BSA）的响应图WWW.2005070559第59页，课件共65页，创作于2023年2月DNAprobeAbsorptionandfluorescenceemissionspectraofethidiumbromdeboundtoDNAEthidiumbromide溴化乙锭2005070560第60页，课件共65页，创作于2023年2月DNAprobeHoechst33258(bis-benzimide)AbsorptionandfluorescenceemissionspectraofHoechst33258boundtoDNA.2005070561第61页，课件共65页，创作于2023年2月Normalandcamptothecin-treatedbovinepulmonaryarteryendothelialcells(BPAEC)werestainedwithC4-BODIPY500/510C9(B-3824andHoechst33258(H-1398,H-3569).BODIPYandHoechstfluorescencewererecordedusinglongpassfiltersappropriateforfluoresceinandDAPI,respectively.AnoverlayoftheimagesindicatesthataredshiftinBODIPYfluorescenceissignificantinnormalcells(leftpanel)comparedtothatinapoptoticcells(rightpanel,asindicatedbythefragmentedn