酶微生物生产工艺课件

酶微生物生产工艺27微生物酶制剂生产工艺酶微生物生产工艺27.1酶生产概论一、酶的定义和分类二、酶的特性三、酶的来源四、酶的生产菌种五、产酶菌株的制备和优化酶微生物生产工艺27.1.1酶的定义和分类酶的定义----酶是生物体内具有特殊催化功能的蛋白质。酶的分类----分为6大类

1、氧化-还原酶

2、转移酶

3、水解酶

4、裂合酶

5、异构酶

6、连接酶（合成酶）酶微生物生产工艺27.1.2微生物酶工业的发展概况早期应用：制曲酿酒1894年，用米曲生产淀粉酶作为消化药二次世界大战后，深层培养技术成功，酶工业快速发展：1949年深层发酵生产淀粉酶日本二十世纪50年代，糖化酶用于葡萄糖生产，60年代，碱性蛋白酶应用于加酶洗衣粉70年代后，酶固定化技术发展，固定酰化酶用于氨基酸拆分，固定葡萄糖异构酶用于高果糖浆生产，近年来有开发了青霉素酰化酶、异淀粉酶、天冬酰胺酶酶微生物生产工艺目前，自然界发现的酶有2500多种，结晶分离的有数百种，有工业应用价值的60多种，已经大量生产的只有20多种。酶微生物生产工艺27.1.3酶制剂的应用1、有机合成和制药工业：酶反应与常规的化学合成结合，如延胡索酸+氨→L-天冬氨酸减少步骤，降低成本，无公害，收率高，副产物少。天门冬氨酸酶酶微生物生产工艺2、医药：消化酶类

溶血栓酶类3、化学分析和临床检验

酶法分析：微量、灵敏、精确高效酶微生物生产工艺27.1.4酶制剂的生产酶的来源1、酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中，可以直接从生物体中分离提纯而获得，早期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。2、人工合成酶的方法，目前还受到试剂、设备条件的限制。3、利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶，由于周期较长、成本较高，也存在一定难度。4、利用微生物生产酶制剂。酶微生物生产工艺利用微生物生产酶制剂的优点（1）能够生产酶的微生物种类繁多，有较大的选择余地。（2）微生物繁殖快、培养周期短、培养方法简便，培养过程容易控制，（3）微生物易变异，具有较强的适应性，能够培育出新的高产菌株。酶微生物生产工艺发酵法生产酶的方式1、固体培养法固体培养法亦称麸曲培养法，该法是利用麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基。一般适用于霉菌的生产。2、深层液体培养法液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为液体表面培养和液体深层培养两种。是目前常用的方法。但无菌要求高。酶微生物生产工艺27.2酶合成的代谢调节及育种酶微生物生产工艺27.2.1酶生物合成的调节定义：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。酶微生物生产工艺

操纵子——基因表达的协同单位操纵子结构基因（编码蛋白质,structuralgene,S）控制部位操纵基因（operatorgene,O）启动子（promotorgene,P）（一）基因调控理论

JacobandMonod的操纵子学说（operontheory）

酶微生物生产工艺基因操纵子调节系统示意图

调节基因启动基因操纵基因结构基因

DNA

转录（-）RNA聚合酶（+）转录

翻译

mRNA

翻译

阻遏蛋白蛋白质

诱导剂

控制区信息区操纵子酶微生物生产工艺

调节基因(regulatorgene)：

可产生一种组成型调节蛋白(regulatoryprotein)（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。酶微生物生产工艺cAMP-CRP复合物的作用示意图

启动基因（promotorgene）（启动子）：

有两个位点：（1）RNA聚合酶的结合位点（2）cAMP-CAP的结合位点。CAP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。

只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。

酶微生物生产工艺操纵基因（Operatergene）:

位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structuralgene）:

决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。酶微生物生产工艺(二)酶合成调节的类型

1.诱导(induction)

组成酶：细胞固有的酶类。

诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似

物而临时合成的一类酶。

2.阻遏(repression)

分解代谢物阻遏(cataboliterepression)

反馈阻遏(feedbackrepression)酶微生物生产工艺（三）酶合成的调节机制

1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。

酶合成诱导的现象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；

（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；

（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。酶微生物生产工艺调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构

B、乳糖酶的诱导

乳糖

阻遏蛋白（有活性）诱导酶微生物生产工艺

2.末端产物阻遏

由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。

酶合成阻遏的现象：

实验：

（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。酶微生物生产工艺色氨酸操纵子——酶的阻遏调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达酶微生物生产工艺酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因启动基因调节基因结构基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达诱导物诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达阻遏蛋白(无活性)酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达代谢产物酶微生物生产工艺调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性－＋不转录，继而不翻译诱导物－转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性－阻遏物＋不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶微生物生产工艺3.分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。酶微生物生产工艺分解代谢物阻遏现象：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasicgrowth）。

这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。酶微生物生产工艺分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP浓度使CAP呈失活状态酶微生物生产工艺27.2.2、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）

1.诱变育种(1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株(2)使阻遏型变为去阻遏型

选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏

选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株

2.基因工程育种酶微生物生产工艺（二）条件控制1.添加诱导物

酶的底物类似物最有效。2.降低阻遏物浓度

除去终产物产物阻遏

添加阻止产物形成的抑制剂

避免使用葡萄糖分解代谢物阻遏避免培养基过于丰富

添加一定量的cAMP酶微生物生产工艺3.添加表面活性剂

离子型对细胞有毒害作用表面活性剂Tween－80

非离子型增加细胞通透性TritonX－1004.添加产酶促进剂酶微生物生产工艺27.2.3目前常用的产酶微生物大肠杆菌---用来生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β-半乳糖苷酶。曲霉（黑曲霉、黄曲霉）---用来生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶。枯草杆菌---用于生产a-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶。啤酒酵母---用来生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶。青霉菌---用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5`-磷酸二酯酶、脂肪酶。木霉菌---用于生产纤维素酶。根霉菌---用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。链霉菌---用来生产葡萄糖异构酶。酶微生物生产工艺27.3产酶菌株的制备和优化1、产酶菌株的培养条件2、菌种的分离筛选3、菌种的变异诱导技术4、原生质体诱导实际生产例子酶微生物生产工艺1、产酶菌株的培养条件（1）产酶促进剂（2）影响酶产量的各种因素（3）诱导剂和抑制剂酶微生物生产工艺（1）产酶促进剂在酶制剂的生产过程中，如果添加少量的某种物质就能增加酶的产量，则这类物质就称为产酶促进剂。产酶促进剂多数是酶的诱导物、或者是表面活性剂，常用的产酶促进剂有：（A）吐温-80（B）脂肪酰胺磺酸钠（C）聚乙烯醇（D）糖脂（E）乙二胺四乙酸（EDTA）酶微生物生产工艺（2）影响酶产量的各种因素A、温度---各种产酶微生物对于温度的要求是各不相同的。细菌：35-37度霉菌：30度酵母菌：30-35度B、PH值---通过掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通过添加缓冲剂、能够控制发酵液的PH值。C、通气量（供氧量）讫今为止，产酶和微生物都是需氧性的微生物。在液体深层发酵中，微生物利用的氧必须是溶解于培养基中和溶解氧。空气中的氧气---培养基溶解氧---透过细胞膜进入原生质。精确测定时采用溶氧仪。D、搅拌---搅拌可将泡沫打碎、增加氧气的溶解速度、加强了液体的湍流作用，有利于营养物质与菌体细胞的接触，促进细胞新陈代谢。E、泡沫酶微生物生产工艺E、泡沫酶制剂发酵过程中泡沫较多。泡沫的存在会阻止CO2的排除、同时直接影响O2的溶解。排除常常采用：机械力消泡沫法、化学消泡剂消泡沫法。常用的消泡剂有：天然油类、矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、磷酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷等等物质。国内酶制剂工业常用的消泡剂为：甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚）酶微生物生产工艺（3）诱导剂和抑制剂某些酶反应，当培养基中不存在诱导物质时，其酶的合成就受到抑制，而当添加诱导物质时，酶的合成就能顺利进行，这类物质称作诱导剂。使用某些酶的抑制剂常常能够促进酶的合成，如在多粘芽孢杆菌的培养基中添加淀粉酶抑制剂S-AI，能增加淀粉酶的产量。在酶的生产中，加入适量表面活性剂，也能提高酶制剂产量，如用爪哇真青霉生产纤维素酶时，如果添加0.1%的吐温-80，则纤维素酶的产量可提高4倍。酶微生物生产工艺27.4酶类药物的提取和纯化一、生物材料的预处理（一）动物材料的预处理1、机械处理

用绞肉机绞，一般细胞并不破碎。有的酶必须细胞破碎后才能有效地提取，在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。2、反复冻融

冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶释放出来。酶微生物生产工艺3、丙酮粉

组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减少酶的变性，同时因细胞结构成份的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于0.0lmol／L，pH6.5的磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃无水丙酮内，10分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。酶微生物生产工艺（二）微生物的预处理

要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬液后再行提取。菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保存。干燥法，因为干燥常能导致细胞自溶，增加酶的释放，从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期目的。

1、干燥法：

①空气干燥25～30℃

②真空干燥还原剂作保护剂(如谷胱甘肽）

③冷冻干燥对较敏感的酶宜用此法。

2、机械法：常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法等。酶微生物生产工艺3、酶法处理

用得最多的是溶菌酶，用量为细胞压积重的1/1000.如在37℃，pH8.0下对小球菌进行破壁处理，历时15分钟，即可提取核酸酶。也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。二、酶的提取1、水溶液法

常用稀盐溶液或缓冲液提取。一般在低温下操作。在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。一般来说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性溶液提取。酶微生物生产工艺

盐浓度一般以等渗为好，相当于0.15mol／LNaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。2、有机溶剂法

某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。丁醇的特性：a亲脂性强，b兼具亲水性。C在脂与水分子之间起类似去垢剂的作用。

丁醇提取方法：一是均相法，少量丁醇，搅拌均匀，提取较长时间，离心，取下层液相。二是二相法，适用于易在水溶液中变性的酶。方法是每克组织干粉或干菌体用丁醇5毫升，搅拌20分钟，离心，取沉淀。酶微生物生产工艺

3、表面活性剂法表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。酶微生物生产工艺三、酶制剂的工业提取法（一）发酵液的预处理及过滤

微生物发酵液的分离，过滤，发酵液中加絮凝剂或凝固剂。絮凝剂有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸。（二）酶液的脱色活性炭、脱色树脂。（三）盐析法用得最多的是（NH4）2SO4，在常温下不会造成酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少。酶微生物生产工艺（四）有机溶剂法

有机溶剂沉淀蛋白质的能力为丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂喷雾干燥用于干燥菌体，药用酶常用冷冻干燥。四、酶的纯化评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活，二是总活力回收。

酶微生物生产工艺酶在纯化过程中的一些技术难点：（一）杂质的除去

酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等。（1）pH和加热沉淀法

（2）蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。酶微生物生产工艺（3）选择性变性法

利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸处理。（4）核酸沉淀剂法

用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于离心分离。用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。（5）将酶与底物结合

酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，热稳定性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。酶微生物生产工艺（二）脱盐和浓缩1、脱盐脱盐方法是透析和凝胶过滤。2、浓缩

酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。（三）酶的结晶把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50%以上），可使其结晶，酶的纯度经常有一定程度的提高。为研究蛋白质空间结构提供X射线衍射样品。酶微生物生产工艺1、酶的结晶方法

酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。（1）盐析法

操作要在低温下进行，加盐，缓冲液pH要接近酶的等电点。多数酶就可形成结晶。有时也可交替置在4℃冰箱中和室温下来形成结晶。（2）有机溶剂法

酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。一般要含少量无机盐的情况下，选择使酶稳定的pH，缓慢地滴加有机溶剂。使用的缓冲液一般不用磷酸盐，而用氯化物或乙酸盐。酶微生物生产工艺（3）复合结晶法有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或盐的性质来结晶。（4）透析平衡法（5）等电点法2、结晶条件的选择（1）酶的纯度酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的单晶可能性也越大。结晶对酶有明显的纯化作用。（2）酶的浓度（3）温度结晶的温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变性。酶微生物生产工艺（4）时间结晶形成的时间,数小时到几个月，有的甚至需要1年或更长时间。一般来说，较大而性能好的结晶是在生长慢的情况下得到的。一般希望使微晶的形成快些，然后慢慢地改变沉淀条件，再使微晶慢慢长大。（5）pH

调整pH可使结晶长到最佳大小，也可改变晶形。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的等电点附近。（6）金属离子

许多金属离子能引起或有助于酶的结晶，在酶的结晶过程中常用金属离子有Ca2+、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ni2＋等。酶微生物生产工艺（7）晶种

不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微量的晶种才能结晶，（8）结晶器皿处理

结晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用结晶母液再冲洗一次。结晶的玻璃器皿，可用硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿。这样可减少晶核数目，形成大的结晶。（四）酶分离和纯化工作的注意事项1、防止酶蛋白变性2、防止辅因子的流失3、防止酶被蛋白水解酶降解酶微生物生产工艺

27.5酶类药物

一、药用酶类的概述

早期酶制剂主要用于治疗消化道疾病，烧伤及感染引起的炎症疾病，现在国内外己广泛应用于多种疾病的治疗，其制剂品种已超过700余种。（一）促进消化酶类

（二）消炎酶类

（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类（四）抗肿瘤的酶（五）其它药用酶酶微生物生产工艺（一）胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）

胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。1、组成（结构）、性质药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。水溶液呈酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。

pI为pH1.0，最适pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和pH4的20％乙醇中。

胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物。酶微生物生产工艺2、生产工艺（1）工艺路线：

胃蛋白酶原盐酸催化激活成胃蛋白酶。常用的脱脂剂有乙醚、氯仿、四氯化碳。酶微生物生产工艺（2）工艺过程：（3）胃膜素和胃蛋白酶联产工艺：向经消化、提取、脱脂、分层、浓缩及60％丙酮沉淀分离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至比重为0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉出，静放过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。（4）结晶胃蛋白酶的制备：药用胃蛋白酶原粉，溶于20％酒精中，加H2SO4调pH3.0，5℃静置20h后过滤，加硫酸镁至饱和，进行盐析。盐析物再在pH3.8～4.0的乙醇中溶解，过滤，滤液用硫酸调pH至1.8～2.0，即析出针状胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4的乙醇中，过滤，滤液用硫酸调pH至1.8，在20℃放置，可得板状或针状结晶。酶微生物生产工艺（二）胰蛋白酶

胰蛋白酶是从牛、羊胰脏提取、结晶的冻干制剂。易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用，胰蛋白酶的pI为10.1。

牛胰蛋白酶在肠激酶或自身催化下，释放出6肽，变成有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶分子量24000，由223个氨基酸残基组成。

胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组成的肽键。酶本身很容易自溶。酶微生物生产工艺2、生产工艺（1）工艺路线：酶微生物生产工艺（三）糜蛋白酶（Chymotrypsin，EC3.4.4.5）胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成α-糜蛋白酶。2、生产工艺（1）工艺路线：（2）工艺过程：

酶原加少量胰蛋白酶，pH7.6酶微生物生产工艺（四）尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）

尿激酶，是一种碱性蛋白酶。由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。人尿平均含量5～6国际单位／m1。1、组成（结构）性质（1）尿激酶有多种分子量形式。尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶降解成为尿激酶。（2）尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于精氨酸-缬氨酸键使纤溶酶原转为纤溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。酶微生物生产工艺（3）尿激酶的pI为pH8～9，主要部分在pH8.6左右。溶液状态不稳定，冻干状态可稳定数年。加入1％EDTA、人血白蛋白或明胶可防止酶的表面变性作用。2、生产工艺（1）工艺路线：酶微生物生产工艺（2）工艺过程：硅藻土吸附，0.02％氨水加0.1mol／L氯化钠洗脱。QAE—Sephadex层析柱去热原、色素。CM—C浓缩。

酶微生物生产工艺（五）细胞色素C（CytochromeC）

细胞色素C存在于自然界中一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。以哺乳动物的心肌、鸟类的胸肌和昆虫的翼肌含量最多，肝、肾次之，皮肤和肺中最少。

1、组成（结构）、性质

细胞色素C是含铁卟啉的结合蛋白质，铁卟啉环与蛋白质部分比例为1∶1。猪心细胞色素C分子量12200。pI为pH10.2～10.8。酶微生物生产工艺

细胞色素C对干燥、热和酸都较稳定。氧化型呈水溶液深红色，在饱和硫酸铵中可溶解。

还原型水溶液呈桃红色，溶解度较小。2、生产工艺（1）工艺路线：酶微生物生产工艺人造沸石pH7.5吸附，蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，25％硫酸铵溶液洗脱。20％三氯醋酸沉淀细胞色素C，AmberliteIRC－50（NH4＋）树脂柱吸附。酶微生物生产工艺（六）溶菌酶（Lysozyme）

溶菌酶，又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。它广泛存在于鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，其中以蛋清含量最丰富。溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，具有抗菌、抗病毒、抗炎症。1、组成（结构）和性质

溶菌酶是一碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸（如色氨酸）比例很高。酶微生物生产工艺

溶菌酶能催化粘多糖或甲壳素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键。溶菌酶是一种罕见的稳定蛋白质。在pH5.5加热4h后，酶变得更活泼。低浓度的Mn（10-7mol／L）在中性和碱性条件下能使酶免受热的失活作用。酶微生物生产工艺2、生产工艺（1）工艺路线酶微生物生产工艺（七）L-天门冬酰胺酶（L-asparaginase）1、组成（结构）、性质

L-天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病。性状呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。最适pH8.5，最适温度37℃。L-天门冬酰胺酶的产生菌是霉菌和细菌，故可作制造酶的原料。酶微生物生产工艺2、生产工艺（1）工艺路线：酶微生物生产工艺（八）激肽释放酶（Kallikrein）

激肽释放酶是一种蛋白酶。哺乳动物的激肽释放酶有两大类：血液激肽释放酶和组织激肽释放酶。药用激肽释放酶又称血管舒缓素，主要来自颌下腺或胰腺。酶微生物生产工艺

猪胰激肽释放酶是一种糖蛋白，含有唾液酸，在腺体中以酶原形式存在。唾液酸的除去并不影响酶的活性。（1）专一性激肽释放酶是一种内切蛋白水解酶，当它作用于蛋白质底物激肽原后释放出激肽。激肽释放酶只作用于天然激肽原。（2）稳定性一般说，激肽释放酶的纯度越高，稳定性越差。在水溶液中不稳定，但在pH8.0的水或缓冲液中，可在冷冻状态下保存相当长时间不失活。

酶微生物生产工艺2、生产工艺（1）工艺路线：（2）工艺过程：

冷丙酮33％、70％，用丙酮、乙醚脱脂、脱水