西伯利亚鲟鱼种质鉴定方法

西伯利亚鲟鱼种质鉴定方法龄项目鱼种8月龄成鱼3龄亲鱼10龄全长体长体长:,不同年龄组的西伯利亚鲟鱼体长和体重范围见表2。

表2西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围12345年龄体长40,5050,7070,8590,100100,120体重400,6001500,20003000,40005000,70007000,9000依据北方地区流水养殖模式,:自然条件下雌鱼为19龄,20龄,雄鱼为17龄,18龄;人工养殖条件下雌鱼为7龄以上,雄鱼为5龄以上。

繁殖周期:野生状态下为2年以上;人工养殖条件下为1年以上。

怀卵量占体重的10%,30%。

=。

同工酶有6条酶带,电泳图及酶带电泳模式图见图2。

图2西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及模式图1为电泳图谱,扩增的结果如图3所示。

图3引物的扩增产物1为西伯利亚鲟池,2、3为西伯利亚鲟个体,,西伯利亚鲟在这14对引物的等位基因长度范围见表3。

基因型数据分析结果见图4。

表314个微卫星引物序列及其在西伯利亚鲟的等位基因长度范围位点名称引物序列5’-3’等位基因长度范围-1101::143,203-105::157,173-107::188,242-109::162,300-114::201,2513-117::191,25939::178,27640::384,41841:322,41019::120,13922::140,24239::119,14054::149,22168::128,250表示西伯利亚鲟品种池表示非西伯利亚鲟样品图4微卫星标记基因型数据分析结果图,。

,,低速1000离心3,弃上清。

%的生理盐水洗涤三次后,在管中加满70%的冷乙醇固定过夜,留意固定时使细胞充分散开。

,用酶10μ,20μ37;碘化丙碇50μ4染色30。

,加入适量的同样处理的鸡血红细胞,上流式细胞仪测定荧光强度,计算西伯利亚鲟鱼与鸡血细胞=荧光强度之比,即可得到鲟鱼的含量。

。

,放血。

随后解剖,,置于0生理盐水中,用生理盐水洗去组织血污。

然后称重,放入玻璃匀浆器中,按1:5。

匀浆后在4冰箱放置1小时,4条件下,12000离心30,吸取上清液,,-80低温冰箱中保存,供同工酶电泳分析用。

:-,分别胶为10%,浓缩胶为4%,小型双垂直电泳槽电泳电压100,电泳时间为9,10,之后改为电压60,电泳时间为6,7。

:每槽加样7μ,与等体积的溴酚蓝蔗糖液混匀后加样,在4冰箱中进行电泳。

:将α--***中,,。

凝胶板在37与染色液,保温30,50,即可呈现棕红色同工酶区带,用蒸馏水冲洗3次后,7%醋酸固定。

,进行尾椎静脉采血,抗凝,去除血浆后-20保存。

,置于75%酒精中常温保存。

***仿法抽提个体基因组,利用紫外分光光度法确定浓度,将个体基因组液稀释至浓度10μ;从每个个体基因组的稀释液中取出10μ集于一管中,制成品种的池。

+扩增反应总体积为25μ,其中包括摸板30、10缓冲液含、2μ、酶5μ、引物1法和微卫星法分别使用各自的引物。

法反应程序为:95预变性5,9445、3645、7290,45,72延长5。

微卫星法反应程序为:94变性45、退火45各引物退火温度详见表4、72延长45,40,72再延长5。

扩增反应结束后,取5μ产物与1μ上样缓冲液混合点样,%琼脂糖凝胶中电泳1,2,电压80伏,紫外灯下观看结果并拍照记录。

表414个微卫星位点重复序列结构和退火温度位点名称重复序列结构退火温度-11015510-1055015-10757175-10955520-1146023-11755839581840616124165171953522525193955145455226855,94解链5,快速置于冰中冷却至室温,4保存备用。

使用95%酒精把长板擦洗一遍,;再使用95%酒精把短板也擦洗一遍,待酒精挥发后涂200μ剥离溶液。

取6%变性聚丙烯酰***溶液80,加入60μ四***乙二***,180μ的10%过硫酸铵现用现配,充分混匀后灌入两块玻璃之间。

用鲨鱼齿梳子的背面沿两玻璃板缝隙水平插入胶中约5-6。

,拔出梳子,用自来水将玻璃板表面冲洗洁净,擦干后装在电泳槽上。

缓冲液,使缓冲液没过短板。

1800恒压预电泳20。

预电泳之后,在每个加样孔中加入5μ解链后样品,-。

电泳结束后,当心分别两块玻璃板,将粘有凝胶的长板浸入染色液中,染色5-15,用蒸馏水漂洗30,浸入在显影液中显影至带型清楚,再用蒸馏水漂洗5。

晾干长板后,拍照纪录结果。

,基因型判读同上述法。

使用荧光微卫星引物进行扩增时,直接使用基因