免疫学技术-化学发光免疫技术（临床免疫检验课件）

电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析是目前非常先进的标记免疫测定技术，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，具有灵敏、快速和稳定的特点，在固相标记免疫测定中技术上居领先地位前言电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，通过抗原抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定量分析，包括电化学和化学发光两个过程电化学发光免疫分析电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+是电化学发光剂，以修饰后的三联吡啶钌直接标记抗原或抗体，以三丙胺作为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+发光原理检测原理检测原理关键技术将待偶联的抗体以适当浓度溶解于碳酸氢钠溶液中；用二甲基甲酰胺(DMF)溶解生物素。按一定摩尔浓度比将两者混合，室温下搅拌之后透析除去游离生物素生物素标记抗体的制备链霉亲和素可以吸附在纳米磁性微球表面上。一些纳米磁性微球表面带有某些功能基团，可通过化学键与链霉亲和素分子连接链霉亲和素与纳米磁性微球的偶联方法评价123标记物性质稳定抗干扰能力强具有灵敏度高、线性范围宽、反应时间短、试剂稳定性好等特点三丙胺溶液可重复使用，在电极表面氧化还原反应周而复始进行，光信号更强、持续时间更长，易于测定临床应用激素贫血因子肿瘤标记物病原体血清标志物甲状腺激素生殖激素肾上腺激素垂体激素维生素B12叶酸红细胞叶酸铁蛋白AFPCEAPSACA19-9HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb胰岛素C-肽肌红蛋白肌钙蛋白骨胶原酶脱氧吡啶啉总lgE特异性lgE茶碱地高辛环孢素巴比妥治疗药物监测过敏性疾病骨代谢糖尿病和心血管疾病01020304电化学发光免疫分析的方法类型电化学发光免疫分析的关键技术电化学发光免疫分析的临床应用

小结电化学发光免疫分析的检测原理思考题1.电化学发光免疫分析的原理是什么？方法类型有哪些？2.常用的电化学发光剂是什么？发光氧通道免疫分析发光氧通道免疫分析采用均相化学发光技术路线，具有均相、免洗、光激发等技术特点，不需要多次洗涤、分离，属于均相反应模式前言发光氧通道免疫分析发光氧通道免疫分析（LOCI）是以纳米微粒为基础的均相化学发光免疫技术发光氧通道免疫分析反应体系覆盖有亲和素和酞菁染料的乳胶聚苯乙烯微球，可以吸收680nm的光，生成高能单线态氧感光微球（纳米级）反应体系发光微球含有烯烃染料和特异性抗体（抗原），可以与单线态氧反应，发出612nm光信号，被LOCI检测器读取发光微球（纳米级）反应体系可以与含有亲和素的感光微球结合感光微球发光微球生物素化抗体（抗原）检测原理方法类型双抗体夹心法双抗原竞争法无需分离结合物与游离物，为均相化学发光免疫技术分离方法技术要点采用长臂活化生物素优化反应体积、最适反应条件等选择一对相互匹配的抗体分别用于包被发光微球和标记生物素经孵育反应使发光微球和感光微球的距离小于200nm纳米微球携带功能基团可直接与蛋白质（抗体）偶联测定产生的荧光信号以双抗体夹心法为例抗体匹配发光微球与抗体偶联生物素标记抗体优化检测体系抗原抗体反应检测临床应用心肌标志物生殖内分泌激素甲状腺激素肿瘤标志物传染病炎症01020304050601020304发光氧通道免疫分析的方法类型发光氧通道免疫分析的关键技术发光氧通道免疫分析的临床应用

小结发光氧通道免疫分析的检测原理思考题1.发光氧通道免疫分析的原理是什么？方法类型有哪些？2.目前该技术的临床应用有哪些？酶促化学发光免疫分析在我国免疫体外诊断行业中，化学发光免疫分析技术凭借其高灵敏度、高特异性，检测时间短，可定量检测，可实现自动化的特点，成为主流技术被广泛应用于临床诊断和科研。我国化学发光行业发展起步较晚，从国内化学发光企业的整体技术水平来看，大部分国产体外诊断产品依然采用酶促发光技术前言酶促化学发光免疫分析(ECLIA)是用参与催化某一化学发光反应的酶标记抗原或抗体，发光底物在酶的催化下发光，通过测定发光强度以实现对待测物质的免疫分析，也称之为发光酶免疫分析(LEIA)酶促化学发光免疫分析酶促化学发光免疫分析酶促反应发光剂利用标记酶的催化作用使底物发光这一类需酶催化后发光的物质称为酶促反应发光剂酶促发光免疫分析根据发光底物性质分类化学发光酶免疫分析荧光酶免疫分析采用荧光底物测定荧光强度采用发光底物测定光强度发光底物发光底物1.鲁米诺及其衍生物：是HRP最常用的发光底物2.对-羟基苯乙酸：是HRP的荧光底物荧光底物1.AMPPD：是ALP常用的发光底物2.4-甲基伞形酮磷酸盐：是ALP的荧光底物辣根过氧化物酶(HRP)的发光底物碱性磷酸酶(ALP)的发光底物检测原理酶促发光免疫分析属于非均相免疫分析系统测定前，需采用固相吸附分离方法将结合标记物(B)和游离标记物(F)分离根据固相载体的不同酶促化学发光又分为板式化学发光和微粒子化学发光板式化学发光板式化学发光免疫分析检测原理微粒子化学发光发光酶免疫分析检测原理微粒子化学发光荧光酶免疫分析检测原理分离技术1用抗原或抗体包被磁颗粒，通过一定反应模式在磁场将结合状态和游离状态酶标记物进行分离磁颗粒分离法包被载体为无磁性微粒子，用纤维膜柱子进行酶标记物的结合状态和游离状态的分离微粒子捕获法23在聚苯乙烯反应珠或反应孔上包被已知抗体，通过洗涤将结合状态和游离状态的酶标记物进行分离包被聚苯乙烯珠或孔分离法方法评价01040203采用纳米微球作为固相载体，比表面积大，结合抗体的容量大，从而拓宽了分析的线性范围酶催化发光底物发出的光稳定，持续时间长，与色源底物相比，具有更高的分析敏感度自动化水平较高酶促发光免疫分析采用酶蛋白作为标记物其活性易受环境因素影响临床应用激素贫血因子肿瘤标记物病原体血清标志物甲状腺激素生殖激素肾上腺激素垂体激素维生素B12叶酸红细胞叶酸铁蛋白AFPCEAPSACA19-9HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb胰岛素C-肽肌红蛋白肌钙蛋白骨胶原酶脱氧吡啶啉总lgE特异性lgE茶碱地高辛环孢素巴比妥治疗药物监测过敏性疾病骨代谢糖尿病和心血管疾病01020304酶促化学发光免疫分析的方法类型酶促化学发光免疫分析的关键技术酶促化学发光免疫分析的临床应用

小结酶促化学发光免疫分析的检测原理思考题1.酶促化学发光免疫分析的原理是什么？方法类型有哪些？2.酶促反应的发光底物有哪些？直接化学发光免疫分析化学发光免疫分析是目前世界公认的先进体外免疫诊断技术，我国大多数三甲医院化学发光免疫分析已成为免疫诊断的主流，直接化学发光免疫分析是目前主流的化学发光技术之一前言简称化学发光免疫分析（CLIA）是用化学发光剂吖啶酯（AE）标记抗原或抗体，以纳米微球作为固相载体，在碱性校正液作用下结合标记物发光，通过测定发光强度以实现对超微量物质的定量分析方法化学发光免疫分析直接化学发光免疫分析化学发光剂化学发光免疫分析使用的发光剂是吖啶酯方法类型夹心法间接法竞争法123检测原理发光标记物的制备吖啶酯标记抗原或抗体前需进行修饰吖啶酯活化吖啶酯固相载体化学发光免疫分析通常采用600~800nm的顺磁性颗粒作为固相载体，在电磁场中，通过洗涤分离出结合状态的标记物方法评价0102吖啶酯具有化学发光反应简单、快速，发光本底较低，无需催化剂等优点0304活化吖啶酯可直接标记抗原或抗体，结合物稳定，不影响吖啶酯发光效率及抗原或抗体免疫活性固相载体采用纳米磁性微球可增大包被面积，加快反应“分离-洗涤”简便、快捷吖啶酯发光为瞬间发光，持续时间短，对信号检测仪的灵敏度要求较高临床应用激素贫血因子肿瘤标记物病原体血清标志物甲状腺激素生殖激素肾上腺激素垂体激素维生素B12叶酸红细胞叶酸铁蛋白AFPCEAPSACA19-9HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb胰岛素C-肽肌红蛋白肌钙蛋白骨胶原酶