第三节-蛋白质一级结构课件

第三节蛋白质的共价结构（一级结构）TheCovalentStructureofProtein蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序和连接方式。蛋白质的一级结构：一、肽和肽键的结构（一）肽的结构：氨基末端（N末端）羧基末端（C末端）结构通式：•

蛋白质分子中氨基酸连接的基本方式是肽键（peptidebond）。•肽链中的氨基酸由于形成肽键而成为不完整的分子，称为氨基酸残基（aminoacidresidue）。有的蛋白质分子还具有二硫键disulfidebond），有链间二硫键和链内二硫键两种形式。

•肽链骨干重复单位是：—N—C—C—小结：Fig.1-9Thepeptidebondisshowninitsusualtransconfiguration.（二）肽键（peptidebond）的结构0.36nmPeptidebondSinglebondDoublebond键长0.145nm0.133nm0.125nm•肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。小结：•肽键是一个平面——肽键平面（peptideplane）或酰胺平面（amideplane），肽键中4个原子及两个相邻的C位于一个平面上。•在大多数情况下，肽键为反式构型（例外：Pro有顺反两种构型）。HHFig.1-10Thetransandcisisomersofapeptidebondinvolvingtheaminonitrogenofproline.Over99.95%ofthepeptidebondsbetweenaminoacidresiduesotherthanProareinthetransconfiguration.

位阻排斥二、肽的物理和化学性质—短肽为晶体，熔点很高。—在水溶液中以兼性离子形式存在。—具旋光性，短肽的旋光度为各个氨基酸的旋光度之和。•物理性质（1）酸碱性质：主要取决于游离末端的-NH2和-COOH及R基上可解离基团。•化学性质例：试判断Gly-Glu-Lys-Ala

在pH6.0时的带电状态。pK´=7.8pK´=4.6pK´=10.2pK´=3.7答：-NH2-COOH-NH2

--COOHpH6.0+-+-所以，在pH6.0时，此四肽所带静电荷为“0”（2）化学反应•茚三酮反应用于肽的定性、定量测量。•双缩脲反应此反应用于测定蛋白质的含量。蓝紫色物质+茚三酮多肽（含两个肽键）多肽（蛋白质）+碱性CuSO4试剂紫红色复合物（双缩脲试剂）三、天然存在的活性肽激素：胰岛素：含两条肽链（分别含30aa和21aa）

催产素（8肽）加压素（8肽）抗生素：短杆菌肽S（环状10肽）放线菌D（含2个环状5肽）毒素：-鹅膏蕈碱（环状8肽）2.脑啡肽1.谷胱甘肽(GSH):3肽：-Glu-Cys-Gly2-Glu-Cys-GlySS-Glu-Cys-GlyGSHGSSG甲硫氨酸型:Tyr-Gly-Gly-Phe-Met亮氨酸型：Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-2H+2H四、蛋白质的一级结构举例[英]Sanger等，1953FrederickSanger1.胰岛素（insulin）Mr:5700DA、B间通过2个二硫键连接，A内还有链内二硫键。含两条肽链A链：20aaB链：31aaFig.1-11Theaminoacidsequenceofthetwochainsofbovineinsulin,whicharejoinedbydisulfidecross-linkages.A7---B7A20---B19A6---A113对二硫键：[美]StanfordMoore,50s’末Fig.1-12Thedisulfidecross-linksoftheribonuclease

2.核糖核酸酶(ribonuclease

)Mr:12600含一条多肽链(124aa)分子内含有4个二硫键:26-84,40-95,58-110,65-723.肌红蛋白(Mb)血红蛋白(Hb)

Hb:四聚体蛋白质（22）：141aa：146aaFig.1-13TheaminoacidsequenceofHemoglobin.Identicalin3(Shaded）Conservedin3(pink)Mb:153aa五、蛋白质分子氨基酸顺序的测定测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子的多肽链断裂多肽链的二硫键测定多肽链的氨基酸组成分析多肽链的N末端和C末端残基将多肽链断裂成肽段，并分离测定各个肽段的氨基酸顺序确定肽段在多肽链中的次序确定原多肽链中二硫键的位置一般原则：（一）测定蛋白质分子中多肽链的数目根据蛋白质摩尔数与末端残基（N端或C端）摩尔数之比确定多肽链的数目。比值=1，含1条肽链----＞单体蛋白质比值≧2，含2条以上肽链----＞寡聚蛋白质（若末端残基多于一种，则蛋白质含有2条或多条不同的肽链）（二）N末端和C末端氨基酸残基的测定1.N末端氨基酸残基的测定•二硝基氟苯法（DNFB法，Sanger法）层析DNFB+蛋白质（多肽）(aan)DNP-蛋白质（DNP-多肽）强酸DNP-aa+(n-1)个游离aaDNP-aa位于有机相有机溶剂抽提（分离和定性定量鉴定）•丹磺酰氯（DNS）法灵敏度高100倍，DNS-aa具强烈荧光，可直接用电泳和层析技术鉴定。苯异硫氰酸酯法（PITC法,Edman法）PITC蛋白质（多肽）(aan)+PTC-蛋白质（PTC-多肽）弱酸加热+PTH-aaaa

n-1有机溶剂抽提PTH-aa位于有机相层析此方法还可用来测定短肽的氨基酸顺序。•氨肽酶法:肽链外切酶，可将aa自N端逐个切下。Fig.1-14Stepsinsequencingapolypeptide.(a)Determinationofaminoacidcompositionand(b)identificationoftheamino-terminalresiduearethefirststepsformanypolypeptides.Sanger'smethodforidentifyingtheamino-terminalresidueisshownhere.TheEdmandegradationprocedure(c)revealstheentiresequenceofapeptide.Forshorterpeptides,thismethodalonereadilyyieldstheentiresequence,andsteps(a)and(b)areoftenomitted.

CF3COOH2.

C末端氨基酸残基的测定•肼解法无水NH2NH2+……苯甲醛氨基酸酰肼氨基酸酰肼与苯甲醛形成二苯基衍生物游离C末端aa位于上清液层析•羧肽酶法羧肽酶A、B、C、YA:释放除Pro、Arg

、Lys之外所有c末端B：释放Arg

、Lys为C末端的aa•还原法：

通过末端aa残基分析，不仅可确定多肽链末端氨基酸，还可确定蛋白质分子由几条肽链组成。C末端aa

被LiBH4还原成氨基醇，再用层析法分离鉴定。返回（三）多肽链的分离和二硫键的断裂变性剂（8M尿素或6M盐酸胍）可破坏非共价键

巯基乙醇（常用）,并以碘乙酸保护还原后的-SH，防止再形成二硫键。多肽链以非共价键相联：（寡聚蛋白）多肽链以二硫键相联：氧化剂还原剂过甲酸（HCOOOH）返回（四）氨基酸组成的鉴定水解方法反应条件产物缺点酸水解6MHCl

或4MH2SO4共煮20hrsL-aaTrp被破坏Ser,Thr,Tyr

一部分被分解Asn

和Gln

的酰胺基被水解下来，生成NH3碱水解5MNaOH共煮20hrsL-aa

和D-aa混合物Arg

脱氨基生成鸟氨酸

采用层析方法鉴定氨基酸组分和含量。目前采用氨基酸分析仪，2-4hrs即可完成。返回胰蛋白酶：R1=

Lys,ArgR2Pro麋蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：R1=

Phe,Trp,TyrR2Pro胃蛋白酶：R1,R2=Phe,Trp,Tyr,Leu等R1Pro嗜热菌蛋白酶：R2=Leu,Ile,Phe,Trp,Val,Tyr,MetR2Pro,Gly葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：R1=

Glu,Asp梭菌蛋白酶（Arg蛋白酶）R1=

Arg

肽链内切酶(五)多肽链的部分断裂和肽段的分离1.酶裂解法木瓜蛋白酶：R1=

Lys,Arg

Fig.1-15Trypsinisaprotease,thatspecificallycleavesonlythosepeptidebondsinwhicharginineorlysinecontributesthecarbonylfunction.CNBr：羟胺(NH2OH)：断裂Asn-Gly之间的肽键

2.化学裂解法R1=

Met,生成肽酰高丝氨酸內酯部分裂解Asn-Leu

和Asn-Ala之间的肽键返回（六）肽段的aa顺序测定Edman化学裂解法

一次可连续测定60-70个氨基酸残基，目前由蛋白质测序仪完成。质谱法（MS）根据核苷酸序列推定返回（七）肽段在多肽链中次序的决定—重叠肽法例：一个9肽，胰蛋白酶降解的肽段Tyr-lys

Glu-Met-leu-Gly-ArgAla-GlyCNBr降解的肽段Tyr-lys-Glu-高Ser内酯

leu-Gly-Arg-Ala-Gly该9肽的aa顺序为：Tyr-lys-Glu-Met-leu-Gly-Arg-Ala-Gly返回（八）二硫键位置的确定—对角线电泳（diagonaleletrophoresis）Fig.1-16IllustrationofDiagonalelectrophoresis过甲酸（HCOOOH）例：从下列信息推导多肽的氨基酸顺序。(a)酸水解得Ala,Arg,Leu,Met,Phe,Thr,2Val(b)Sanger试剂处理得DNP-Ala(c)胰蛋白酶处理得2个肽段，Ala,Arg,Thr和Leu,Met,Phe,2Val,Sanger试剂处理分别得DNP-Ala和DNP-Val(d)以CNBr处理，得两个肽段Ala,Arg,高Ser内酯,Thr,2Val和Leu,Phe。Sanger试剂处理分别得到DNP-Ala,DNP-LeuN端12345678C端AlaThr

ArgValValMetLeu

PheIdentificationoftheamino-terminalresiduecanbethefirststepinsequencingapolypeptide.

Sanger’smethodorEdmandegradationcanbeused.2.Breakingdisulfidebonds

Disulfidebonds(二硫键）,ifexist,needtobebrokenfirst.Thedisulfidebondscanbereducedbydithiothreitol(DTT,二硫苏糖醇)orb-mercaptoethanol(巯基乙醇).3.Determinetheaminoacidcomposition4.PolypeptidechainsarecleavedintoshortfragmentsbychemicalorenzymaticmethodsandthensequencedbyEdmanmethod.

3.1Cyanogenbromide(CNBr)cleavespolypeptidesonthecarboxylsideof

methionineresidues.3.2Asetofproteasescleavepeptidechainsadjacenttospecificaminoacidresidues:Trypsin,specificallyonthecarboxylsideofArgandLys;Chymotrypsin（胰凝乳蛋白酶,糜蛋白酶）,thecarboxylsideofPhe,Tyr,andTrp3.3Thefragmentsthusproducedneedtobeseparated(purified)bychromatographic（色谱分析的）orelectrophoretic（电泳的）methodsbeforetheycanbesequenced.

5.TheaminoacidsequenceofashortpeptidecanbeefficientlydeterminedbyEdmandegradation

5.1Theunchargedterminalaminogroupisreactedwithphenylisothiocyanate(苯异硫氰酸盐,异硫氰酸)toformaphenylthiocarbamyl(苯氨基硫代甲酰基)peptide.5.2TheN-terminalaminoacidresidueisliberatedasacyclicphenylthiohydantoin(PTH)derivativeundermildlyacidconditions,leavingtherestofthepeptidechainintact.5.3ThePTHderivative(thustheaminoacidresidue)canbeidentifiedbychromatographicmethods5.4ThenewlyexposedN-terminalaminoacidresiduecanbeidentifiedbyrepeatingtheaboveprocedure.6.Thepolypeptidehastobecleavedbyatleasttwosetsofreagentstogettheorderoftheshortpeptidesonthepolypeptide.

6.1Asecondsetofshortpeptidesoverlapping（重叠）thefirstsetisneededtoputthefirstsetinthecorrectorder.6.2Ifthesecondsetfailstoprovideappropriateoverlappingsequencesathirdorevenfurthercleavageisneeded.7.Thepositionsofdisulfidebonds,ifexisting,needtobelocated.

Thiscanbeaccomplishedbycomparingpatternsofpeptidefragmentsonelectrophoresisgelswithandwithoutbreakingthedisulfidebonds.六、蛋白质的一级结构与生物功能

Thesequenceofaminoacidsinaproteincanofferinsightsintoitsthree-dimensionalstructureanditsfunction,cellularlocation,andevolution.

（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化

指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质。1.同源蛋白质（homologousprotein）•不变残基（invariantresidue）•可变残基（variableresidue）例：胰岛素（51aa）细胞色素C（104aa+血红素辅基）例：细胞色素C中28个氨基酸是不变残基。Fig.1-17Analysisofthesequenceofcytochromecfrommorethan40differentspeciesrevealsthat28residuesareinvariant.Mr:12500结合蛋白：~100aa+血红素与酶结合结合血红素ThenumberofaminoaciddifferencesamongthecytochromeCsequencesofvariousorganisms.鲤鱼黑猩猩绵羊响尾蛇花园蜗牛烟草天蛾啤酒酵母花椰菜欧防风不同种属同源蛋白质在一级结构具有相似性。亲缘关系越近，结构越相似。Fig.1-18Thisphylogenetictreedepictstheevolutionaryrelationshipamongorganismsasdeterminedbythesimilarityoftheircytochromecaminoacidsequences.2.进化树（phylogenetictree）（二）同源蛋白质具有共同的进化起源

1.氧和血红素蛋白:2.丝氨酸蛋白酶类例：人肌红蛋白

-珠蛋白β-珠蛋白3.一些功能差异很大的蛋白质例：溶菌酶和-乳清蛋白例：胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶水解细菌细胞壁多糖调节乳糖合成

Fig.1-19Inspectionoftheaminoacidsequencesoftheglobinchainsofhumanhemoglobinandmyoglobinrevealsastrongdegreeofhomology.Identical:Mb---:38

---:64Fig.1-20Thisevolutionarytreeisinferredfromthehomologybetweentheamionacidsequencesoftheα-globin(141aa),β-globin(146aa),andmyoglobin(153aa)chains.

返回胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族Comparisonoftheaminoacidsequencesofchymotrypsinogen,trypsinogen,andelastase.

返回Fig.1-21Thetertiarystructuresofheneggwhitelysozyme(12