液即分配色谱法课件

层析技术概述因其操作简便、高分辨率、高灵敏度、选择性好、样品量少、结果准确等特点适合于标本含量少,杂质含量多样品分析尤其适用于生物样品的分离分析层析技术成为已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法，是生命科学、医学实验技术等研究领域必不可少的手段和工具。二、层析技术发展史1903年，俄国植物学家茨维特-将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形-抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙柱-石油醚洗涤柱子上→下：叶绿素b,a,叶黄素，胡萝卜素-混合物的不同组分得到了分离-得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法①②③④层析法进行时有两个相

固定相（支持物），流动相（含待分离物质）。固定相-碳酸钙流动相-石油醚MichaelTswett(1872-1919),theinventorofthemethodofcolumnchromatography这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端,之后20多年，无人关注这一伟大发明1931年，德国库恩重复茨维特实验，并分离60多种色素1938年，从VB中分离B6,出色的研究获得1938年诺贝尔化学奖1941年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液-液即分配色谱法-预测并实现气相色谱技术，1952年将色谱技术原理应用到分离气体上，混合气体通过后，在另一端出现时得以分离-20世纪60年代，普通色谱法已经不能满足人们对生物成分分析测试的要求-高效液相色谱，highperformanceliquidchromatography即HPLC特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。

高效液相色谱法又称高压高速、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。高压泵、进样装置、色谱柱、检测器HPLC的特点1.高压2.高速3.高效

4.高灵敏度三、层析技术原理层析系统由两相组成：一是固定相，另一是流动相流动相：携带流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相三、层析技术原理当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，各组分移动速度各异，因而可将各组份分离若分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，最终达到分离各组分的目的。四、层析技术分类吸附层析法柱层析法（高效液相层析）层析法气相层析法超临界层析法液相层析薄层层析法纸分配层析法其他分配层析法正相分配层析法反相分配层析法毛细管电泳凝胶渗透层析法离子交换层析法亲和层析法四、层析技术分类吸附层析法(absorptionchromatography)：固定相是固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。分配层析(partitionchromatography)：固定相为液体，利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。离子交换层析(ionexchangechromatography)：是以具有离子交换性能的离子交换剂作固定相，利用他与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。四、层析技术分类凝胶层析（gelchromatography）：固定相为多孔性凝胶，利用各组份的分子大小、形状不同，在凝胶上受阻滞的程度不同而得到分离。亲和层析(affinitychromatography)：利用待分离物质和他的特异性配体间具有特异亲和力从而与其他组份分离，如免疫亲和层析。以上各种层析法常应用于柱层析(columnchromatography)中，即将固定相装于柱内，使标本沿一个方向移动而达到分离。离子交换层析原理示意图免疫亲和层析免疫亲和层析五、高效液相层析高效液相层析（Highperformanceliquidchromatography，HPLC）在经典液相色谱和气相色谱的基础迅速发展技术由于固相填料颗粒小而均匀，会引起高阻力，采用高压输送流动相，可大大加快分析速度，故又称高压液相色谱高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样分离系统、检测系统、数据系统等组成。高效液相分析仪结构示意图

储液器输液泵选择装置层析柱检测器数据处理系统馏分装置五、高效液相层析正相层析法：固定相极性大于流动相极性正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等五、高效液相层析反相层析法：流动相极性大于固定相极性反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，与正相正好相反反相层析用于分离非极性或弱极性化合物，如氨基酸和多肽的分析,蛋白质的分离、碱基、核酸和核酸酶的分析、甾体化合物的分析五、高效液相层析反相层析最为常用，优点：反相层析用流动相的价格比正相层析便宜对操作环境的污染较小非极性固定相表面的作用力弱，故色谱柱达到平衡比较快梯度洗脱的柱子更易于“再生”第21页第21页一、氨基酸测定方法概述

氨基酸检测方法主要有筛查试验和定量试验纸层析和薄层层析法用于氨基酸分析鉴定离子交换法常用于氨基酸的分离、定量测定全自动氨基酸分析仪应用，可对各种体液中氨基酸进行测定特异性强灵敏度高的酶法及HPLC第一节体液氨基酸测定第22页1．氨基酸自动分析仪采用离子交换层析方式，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析一次进样检测20～50种氨基酸，不需要更换体系，自动完成仪器基本结构及原理同普通HPLC相似，针对氨基酸分析细节优化，如氮气保护、惰性管路、在线脱气、洗脱梯度及柱温梯度控制等样品用量只需数十至数百微升,在30min左右,即可测出各种氨基酸含量第23页2．HPLC法第23页定量分析氨基酸及衍生物的技术反相层析技术使微量的氨基酸得到分离和定量大多数氨基酸无紫外吸收及和荧光发射特征为了提高检测微量氨基酸的灵敏度，在HPLC前先在氨基酸上标记能产生荧光或紫外有较强吸收的化学物质HPLC分离后可以直接用荧光检测仪或紫外检测仪高灵敏度地检测和定量各种氨基酸第24页3.纸层析和薄层层析第24页纸层析和薄层层析是分离鉴定微量氨基酸最简易有效的方法不需特殊设备和操作简单采集在滤纸上的标本可以邮寄纸层析灵敏度低、分辨率差、费时已经逐渐被速度快、分辨率和灵敏度高的薄层色谱所代替这两类层析均为定性检测第25页4．比色法第25页氨基酸与茚三酮加热产生显色物质的原理设计荧光法检测灵敏度高将其方法代替利用某些氨基酸的特性某些化学物质和特异性的氨基酸起反应可以产生有色物质等色氨酸和甲醛缩合，并被三氯化铁氧化，生成荧光物质去甲哈尔曼用荧光分光光度法进行检测第26页5．酶法分析第26页某些氨基酸在特定酶的作用下发生分解或合成反应，同时伴有NAD+与NADH之间的转化,在340nm监测吸光度的变化,可测定氨基酸的含量。也可在酶的作用下产生显色物质，测定吸光度的变化。

第27页第27页二、离子交换层析法测定氨基酸离子交换层析用离子交换剂作固定相固定相中的基团与流动相中的离子进行可逆的交换分离样品混合物，其中带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来氨基酸的离子交换分离氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的pI和溶液的pH各种氨基酸分子结构不同，在同一pH值时所带正负电荷的性质不同，所带的电荷量也不同与离子交换树脂的亲和力有差异根据从小到大的亲和力顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的目的。

二、离子交换层析法测定氨基酸收集不同的组分第32页二、离子交换层析法测定氨基酸测定洗脱液吸光度即可绘得洗脱曲线此计算出该蛋白质中各种氨基酸的含量从洗脱峰的位置来判断属于哪一种氨基酸氨基酸分析仪就是根据这个原理设计制造的自动化分析仪氨基酸混合样品阳离子交换树脂洗脱

不含有氨基酸部分控制洗脱液的流量氨基酸浓度洗脱时间阳性离子交换树脂分离氨基酸第34页第34页三、离子交换层析法性能评价1.由于离子交换层析法耗时长，分析过程复杂因此在分析生物样品时，快速敏感的反相高效液相色谱法应用较多很微量的氨基酸样品都可以得到分离和定量2.HPLC虽然此方法由于有较好的可靠性而被广泛使用操作过程中样品准备以及层析分离过程复杂操作