DNA重组载体构建课件

DNA重组载体构建

2010-3-22.GetthetargetDNAsequenceSelectappropriatevectorPCRprimerdesignObtaincellortissuePCRamplificationRestriction,ligationandtransformationScreenpositivecloneSequencing载体构建的一般步骤.

文献检索

通过查阅文献，我们可以获得基因名称、来源、表达谱系等相关信息。常用的外文数据库：

ElsevierScience数据库：荷兰ElsevierScience公司是世界知名出版商，其出版的期刊是世界上公认的高品位学术期刊。ElsevierScience公司提供的1,100多种全文电子期刊，是获取科技论文全文文献的重要途径.

/NCBI=PubMedCentral(PMC)

theU.S.NationalInstitutesofHealth(NIH)freedigitalarchiveofbiomedicalandlifesciencesjournalliterature.

/pmc/基因信息的获取.基因序列查找（/）获取基因序列种属名称RatOlig1...什么是基因载体（vector）：是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的分类：

●按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、病毒载体等。

●按功能:克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。

●按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。载体的选择.能自主复制；具有两个以上的遗传标记物(荧光蛋白，真核抗性标记），便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA（多数质量载体的容量小于5kb）。载体的选择标准.克隆载体.T载体.pCDNA3.1(nonfusionorfusion)pCI-HA(fusionwithHAtag)pRK5-FLAG(fusionwithFLAGtag)pFLAG-CMV(fusionwithFLAGtag)pEGFP-C1/N1pIRES2-EGFP普通表达载体（plasmid）.pcDNA3.1plasmidvector.pcDNA3.1/myc-Hisplasmidvector.pIRES2-eGFPplasmidvector.RNAi实验中，我们经常用到siRNA表达载体（shRNAvector）：shRNA表达载体除了常规载体具有的一些结构之外，最显著的特点就是其启动序列。

shRNA表达载体的启动子：

H1和U6系列为目前shRNA表达载体最常用的启动子，这一类启动子依赖RNA聚合酶III（polIII）。

⑴具有以下明显特性：●广谱表达●转录终止位点明确，即遇到5个连续的T终止转录⑵H1和U6启动子区别：●

U6启动子比H1效率略高，而且表达持续时间相对较长●

H1不要求shRNA序列中sense的第一个碱基一定为“G”，任意碱基均可起始转录特殊载体的选择(RNAi实验).载体结构

1、shRNA特定的启动序列（U6、H1等等）；

2、报告基因，最常用的为GFP/RFP系列；

3、筛选标记物，新霉素(Neomycin)，潮霉素

(Hygromycin)，嘌呤霉素(puromycin)。

现在商业化的载体上用的比较多的是新霉素和嘌呤霉素。也有一些载体同时具有这两种抗性基因。shRNA表达载体的特点.Invitrogen公司

pSilencer™2.1-U6pSilencer™3.1-H1Genscript公司

pRNA-U6.1pRNA-U61.1pRNA-cmv3.1SystemBiosciences（SBI）

pSIH1-H1pSIH1-H1-U6（双启动子）Ambion公司

pSilencer™4.1-CMV常用的shRNA表达载体.RestrictionsitesThesameORFwithfusionpartnerProtectiveresidues引物设计.⑴引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。⑵

产物不能形成二级结构。⑶引物长度一般在15~30碱基之间。⑷G+C含量在40%~60%之间。⑸碱基要随机分布。⑹引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑺引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑻引物5′端可以修饰。

⑼引物3′端不可修饰。

⑽引物3′端要避开密码子的第3位。

引物设计.引物设计（primer5.0、Oligo6）引物设计的常用软件....1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)目的基因的获取.PCR模板●已有带有目的基因的质粒。●细胞或组织TotalRNA反转录的cDNA。DNApolymerase

PCR的条件：目的基因的获取94℃5min94℃30s55℃30s30cycle72℃30s.限制性内切酶酶切PCR产物和质粒载体

单酶切（顺序酶切）

双酶切（*共用Buffer，酶活）纯化酶切产物

切胶回收

（1）跑胶，切胶（2）融胶，回收目的片段（3）紫外分光光度检测DNA浓度

酶切与纯化.PCRproduct:vector3~10:1At25℃for2-3hoursorat16℃overnightInactiveT4DNAligase(at70℃for10min)连接.感受态细胞（DH5a,TOP10,JM109等）酶切鉴定PCR鉴定测序(DNASTAR、sequncer4.2)转化与鉴定...少量与大量制备质粒普通级、转染级、Endofree●普通级(用于酶切鉴定，质粒保存，测序)

●转染级（用于细胞转染）

●Endofree（用于细胞转染）抽提质粒.NR2A-pSFVNR2B-pSFVNR2A-LV-GFPNR2B-LV-GFPRGL-LV-GFPTIP30-LV-GFPOigo1-pGEX-4T1Oigo2-pGEX-4T1Oi