免疫酶组织化学技术-课件

第三章

免疫酶组织化学技术1PPT课件

免疫酶组织化学技术

酶------辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶……

酶标记已知Ab(或Ag)+组织细胞内相应的Ag(或Ab)

抗原抗体复合物(酶标)

底物

有色沉淀定位；图像分析仪半定量2PPT课件免疫组化方法酶标抗体免疫组织化学

直接法间接法非酶标抗体免疫组织化学

酶桥法

PAP法、APAAP法3PPT课件

一、酶标抗体免疫组织化学染色法（一）原理直接法和间接法。

直接法---

是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。

间接法---两步法一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体；二抗：是抗一抗的抗体,并且已用酶标记。

(注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。)4PPT课件原理：将酶直接标记在一抗上，然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。优点：简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。缺点：浪费抗体、敏感性极低。依靠化学连接（共价键）对酶及抗体活性有影响。每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物。酶标抗体法-直接法5PPT课件酶标抗体法-间接法原理：将酶标记在二抗上，先将一抗与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。

优点：只需一种酶标抗体即可。缺点：敏感性低，但优于直接法。依靠化学连接对酶及抗体活性有影响。6PPT课件

免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确定该抗原的性质、存在的部位和含量。酶+底物====不溶性的色素标记酶:辣根过氧化物酶(HRP)

碱性磷酸酶(ALP)

葡萄糖氧化酶(GOD)β-D-半乳糖苷酶……

显色反应

:7PPT课件1辣根过氧化物酶HRP：显色：产物棕褐色

HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。DAB性质：电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期保存。可致癌，可将DAB制成10倍浓度储存液，分装后-20℃贮存。注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着色浓缩的DAB—按照说明书；注意校正蒸馏水的PH值；粉剂DAB----溶解时滤去不溶性颗粒；现用现配---保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。临用前加H2O28PPT课件2碱性磷酸酶ALP：显色：产物蓝色或红色。以磷酸萘酚AS-MX为底物，被ALP水解后生成萘酚AS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成。优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高特异性。缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明确。9PPT课件3GOD(葡萄糖氧化酶)：

以β-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为HRP的催化底物，最后仍可用DAB显色。

适用于两种酶的放大技术：即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。10PPT课件呈色反应注意要点：

①底物浓度：

应够高，保证最大反应速度;

②pH值：

满足酶活性的最适pH，常由缓冲液提供;

③温度：

室温即18℃-22℃，或37℃；

④时间：显色反应时间应在镜下观察来控制，以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可终止反应。11PPT课件（二）染色程序1直接法（冰冻切片）1）新鲜组织切片,冷丙酮固定10min,干燥后,入PBS。2）0.3％H2O2-甲醇液处理30’,封闭内源性过氧化物酶;3）0.0lmol／LPBS洗3次。4)5％-10％正常羊血清室温处理30min。5)1:50-1:100HRP-标记抗体,37℃孵育60’或4℃过夜。6)0.0lmol／LPBS洗3次。7)DAB／H2O2显色(新鲜配制)。8)0.01mol／LPBS洗3次。9)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。12PPT课件2间接法1)石蜡切片脱蜡至水；冰冻切片室温干燥--丙酮固定----缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂2)甲醇双氧水室温处理切片15～30min,封闭内源性过氧化物酶活性。3)PBS漂洗4)0.1％～1％牛血清白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育15～25’,然后吸去孵育液,不冲洗.5%～10％正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育15～20’然后吸去。5)滴加PBS适当稀释的第一抗体,湿盒内孵育,或4℃过夜,或室温2～4h。6)PBS充分冲洗7)滴加适当稀释的酶标第二抗体,湿盒孵育45～60’(室温或37℃)。8)PBS漂洗(3次,每次2-5’)。13PPT课件9)显色：①HRP标记抗体（0.01-0.1%H2O2+0.01-0.5％DAB液）②ALP标记抗体（2mg磷酸萘酚AS-MX+0.2ml二甲基甲酰胺，用前加坚牢红TR盐)。切片入此液,室温10～15’。③GOD标记抗体（β-D-葡萄糖67mg+硝基蓝四唑6.7mg+吩嗪甲硫酸酯0.107mg，37℃孵育1h。10)

流水中终止呈色反应；11)复染细胞核（甲绿、苏木精）；10s12)DAB显色标本-----树胶封固。其它------------水溶性介质(如甘油明胶)封固。13)

镜检结果：按上法HRP阳性者呈棕色，ALP法阳性者呈红色，GOD法阳性者呈蓝色。14PPT课件

二、非酶标抗体免疫组织化学染色法

酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法PAP(一)酶桥法1原理：三种抗体一抗二抗---桥抗体三抗----抗酶(HRP)抗体,酶(HRP)与抗酶抗体结合,经底物的显色反应将抗原显示出来。优点：任何抗体均未被酶标记,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合,避免因共价结合对抗体和酶活性的影响,敏感性高,可节约一抗。需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。15PPT课件非标记抗体酶法—酶桥法原理：首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；以二抗作桥，将抗酶抗体联结在一抗上；再将酶结合在抗酶抗体上，形成抗原-抗体1-抗酶抗体-酶复合物，最后用底物显色剂显色。

优点：任何抗体均未被酶标记。酶是通过免疫学原理与酶抗体结合的。避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，而且节省一抗的用量。缺点：敏感性低，抗酶抗体不易纯化。16PPT课件2酶桥法染色程序⑴～⑸同上述酶标抗体法。⑹滴加第一抗体,于湿盒内4℃孵育16～24h。⑺PBS洗2次，每次5’(可振摇)。⑻加第二抗体(桥抗体),湿盒内室温孵育30～60’。⑼用PBS洗2次,每次5’。⑽加抗酶(HRP)抗体,湿盒内室温孵育30～60’。⑾用PBS洗2次,每次5’。⑿加过氧化物酶(HRP)溶液(70～100μg／m1),湿盒内室温孵育30’。⒀用PBS洗2次,每次5’。换Tris缓冲液洗5’。⒁显色反应及后处理同酶标记法。17PPT课件

酶桥法的缺点：①抗酶抗体内存在低亲和力和高亲和力两类抗体；低亲和力抗酶抗体--与酶结合力较弱，漂洗时易解离，可使约70％的酶丢失，因而降低了方法的敏感性；②在抗酶抗体内，也含有非特异性(抗酶)抗体，因其抗原性与抗酶抗体相同，故也可与桥抗体结合，由于其未与酶结合，也会影响细胞组织内抗原的显示。18PPT课件(二)PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法）

PAP复合物：抗酶抗体+足量的酶==形成稳定的五角形复合物

(由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成)

原理：三种抗体

PAP复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。一抗二抗---桥抗体

PAP复合物要求：抗酶抗体的动物种属应和制各第一抗体的动物相同。

19PPT课件非标记抗体酶法--PAP法双PAP法原理：同酶桥法，只是把抗酶抗体-酶制成复合物（PAP复合物），形成抗原-抗体1-PAP复合物。优点：比直接法、间接法、酶桥法更敏感。特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减弱抗原的检测。

缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床常规检查。20PPT课件优点：

①PAP复合物结构很稳定，冲洗时酶分子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法高20倍；

②PAP是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色；

③双PAP法：通过两次连接桥抗体和PAP复合物，在抗原抗体复合物上结合了更多的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和抗原性减弱的抗原检测。缺点：

①PAP复合物制备较复杂；

②免疫染色步骤多、需时长；

③由于PAP复合物分子量较大，对组织的穿透力不如酶标抗体，故不适于免疫电镜标本制作。21PPT课件2PAP染色程序

⑴～⑸同上述酶标抗体法。

⑹加第一抗体,湿盒内4℃孵育16～24h。

⑺用PBS洗2次,每次5min,可振摇。

⑻加桥抗体(即羊抗兔IgG),湿盒内室温孵育30’⑼用PBS洗2次，每次5’，可振摇。

⑽加PAP复合物(由兔制备抗酶抗体),湿盒内室温孵育3’⑾用PBS洗2次,每次5’。再换入Tris缓冲液洗5’。

⑿用TBS配制的H2O2-DAB底物显色5～10’(镜下观察控制)。

⒀流水冲洗。⒁需要时可复染细胞核。⒂脱水、透明、封固。22PPT课件

双PAP法染色程序：

⑴～⑽同PAP法。

⑾用PBS洗2次，每次5min。

⑿再加桥抗体(羊抗兔IgG抗体，比第一次稀释大一倍)，湿盒内室温孵育30min。

⒀PBS洗2次，每次5min。

⒁再加PAP复合物(比第一次稀释大一倍)，湿盒内孵育

30min。

⒂以后按上述PAP法12～15进行。23PPT课件其它免疫组化方法免疫组化技术成熟的过程=提高IHC敏感性=提高放大信号=抗原+？酶生物素(Biotin)：VitaminH、活化后可标记抗体和酶而不影响其活性卵白素(Avidin):亲和素、抗生物素碱性蛋白质；具有4个生物素结合位点链霉卵白素：从链霉菌中提取出来，等电点接近中性，对组织细胞的非特异吸附很低，是与生物素结合更加完美的一种蛋白质。生物素-卵白素、生物素-链霉卵白素：具有高度亲和力，是抗原抗体结合能力的上千倍。ABC法、SP法、SABC法、EnVision法、CSA法……24PPT课件

ABC法（亲和素－生物素－过氧化物酶复合物法）亲和素Avidin:糖蛋白，其上有四个与生物素相结合的位点。生物素Biotin：维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。

1）ABC复合物的制备：25PPT课件ABC法反应原理26PPT课件ABC染色程序

⑴～⑸同上述酶标抗体法。

⑹加第一抗体,湿盒内4℃孵育16～24h。

⑺用PBS洗2次,每次5min,可振摇。

⑻加生物素化抗体(即羊抗兔IgG),湿盒内室温孵育30’⑼用PBS洗2次，每次5’，可振摇。

⑽加ABC复合物(亲合素一生物素过氧化物酶复合物

),湿盒内室温孵育3’⑾用PBS洗2次,每次5’。再换入Tris缓冲液洗5’。

⑿用TBS配制的H2O2-DAB底物显色5～10’(镜下观察控制)。

⒀流水冲洗。⒁需要时可复染细胞核。⒂脱水、透明、封固。27PPT课件SP/SAP法

该法是ABC法基础上的进一步改良.

与链霉卵白素（而非生物素）结合，而后再结合PO。它有四个亚基可与生物素结合，灵敏度特异，背景低，成本低。优点：更简洁，放大倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小，穿透力↑。一抗+生物素标记二抗+辣根酶标记链霉卵白素+辣根酶底物显色28PPT课件其它免疫组化方法----SP原理：+一抗+生物素化二抗+HRP标记的链霉卵白素优点：高灵敏度低背景操作方便缺点：不适用于内源性生物素丰富的组织

（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色)29PPT课件三步法（以SP试剂盒为例）

•

石蜡切片脱蜡至水。

•

蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

•3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

•5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。

•PBS冲洗，2分钟×3次。

•

滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。

•PBS冲洗，2分钟×3次。

•

滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。

•PBS冲洗，2分钟×3次。

•

显色剂显色（DAB或AEC）。

•

自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。30PPT课件SABC法原理：一抗＋生物素化二抗＋SABC复合物SABC复合物链霉卵白素－生物素－过氧化物酶生物素标记的二抗链霉卵白素连接生物素标记的酶。优点：敏感性略高于SP法，低背景和操作简便缺点：因体内含有内源性生物素，易产生非特异性染色。

其它免疫组化方法----SABC一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC（链霉卵白素+辣根酶标记生物素)+辣根酶底物显色

31PPT课件SP法：

一抗+生物素标记二抗+辣根酶标记链霉卵白素

+辣根酶底物显色

SABC法：

一抗+生物素标记二抗+滴加试剂SABC（链霉卵白素+辣根酶标记生物素）+辣根酶底物显色

SABC为：链霉亲合素一生物素过氧化物酶复合物。

ABC为：亲合素一生物素过氧化物酶复合物。

(反应原理是一样的，只是应用的亲和素不同。)32PPT课件原理：将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体

优点：1简便、快速、敏感性是S-P/SABC法的几十倍。2由于人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了组织中生物素的干扰缺点：因大分子穿透核膜困难,对于核内抗原的定位不能选用此法。Envision法其它免疫组化方法----Envision法33PPT课件EnVision工作程序：

1）脱蜡、水化组织切片。

2）预处理组织切片（据一抗具体说明而定）

3）蒸馏水漂洗，置于PBS中。

4）阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）

5）蒸馏水漂洗，置于PBS，10分钟

6）一抗孵育10-30分钟

7）PBS漂洗10分钟

8）EnVisionTM孵育10-30分钟

9）PBS漂洗10分钟

10)色源底物溶液孵育10分钟

11)蒸馏水漂洗

12)复染及封片34PPT课件其它免疫组化方法----CSA法（催化信号放大法）原理：是酪胺的过氧化物酶反应(即HRP催化酪胺盐，形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原—抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的链霉亲和素—HRP结合，如经几次这样的循环放大，可以网络许许多多的酶分子，最后通过DAB的显色反应，其敏感性得到几何级放大。优点：比EnVision法敏感20～100倍。适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量较少的组织细胞抗原的检测方法;核内抗原的检测（原为杂交）。缺点：操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源性干扰，背景染色有时较重。35PPT课件三、免疫酶组织化学染色操作中的注意事项1实验设计列出实验目的;

所有抗体种类;

拟用方法;

选用病例的诊断及其切片(如系动物实验，则同样应有研究计划)，应逐一记于玻片上，可用编码或符号表示;

每一抗体均应配以阳性或阴性对照

2湿盒孵育技术

将切片平放于湿盒中，滴加抗体.

切片较多，可分2～3组，以便流水作业，则可在一次试验内不停地完成大量工作,放入切片后加盖以防干燥，置37℃恒温箱内孵育。36PPT课件3抗原修复

定义：抗原修复是指恢复抗原原有的空间状态。

原理：组织经甲醛等固定后，形成醛键而封闭了抗原，或者被甲醛在蛋白质之间形成的交联结构所隐蔽，因此，在进行免疫组织化学染色时，需要破坏分子间的交联等结构修复或暴露被封闭或隐藏的抗原。抗原修复后可以重新释放抗原，从而增加染色强度。

方法：化学修复法、物理化学修复法(1)化学修复法

胰蛋白酶、胃蛋白酶、链酶蛋白酶等。1)0.1％胰蛋白酶液：孵育前将胰蛋白酶溶入氯化钙液内,混匀后,放入切片,消化5-30’。2)0.4％胃蛋白酶液：溶于0.01mol／L盐酸中,37℃消化5-30’。3)0.06％链霉蛋白酶液：溶于0.5mol／L的Tris缓冲液中,37℃消化5-30’。37PPT课件(2)物理化学修复法器具：微波炉、真空负压干燥箱、高压锅、电炉或水浴锅等抗原修复液:TBS、PBS、重金属盐溶液等，其中以0.0lmol／L枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)最常用。1)微波辐射抗原修复法

切片脱蜡至水双蒸水洗放到盛有枸橼酸盐缓冲液容器中置微波炉内加热92-98℃以上持续10-15min取出自然冷却注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却。然后，经双蒸水、PBS洗，下接免疫组织化学步骤。原理：该法利用微波24.5亿次／秒的高速运动产生瞬间热，微波辐射使各分子作极性运动，热使甲醛固定的蛋白质发生变性，在此双重作用下，达到抗原修复目的。38PPT课件2)高压热抗原修复法

切片脱蜡到水后，置金属切片架上。将盛有枸橼酸盐缓冲液的不锈钢高压锅加热至溶液沸腾。将切片架放到锅内，加盖压力阀，压力锅喷气持续l-2min，再将压力锅端离热源，凉至室温后，去阀开盖，取出切片，经双蒸水、PBS洗，下接免疫组织化学步骤。这也是一种双重作用的方法，高压也易使甲醛固定的蛋向质发生变性，高压下的温度一般在l00～120℃之间。

此法对于较难修复的抗原的修复效果较好。

3)煮沸热抗原修复法

切片脱蜡到水后置金属切片架上，放入盛有枸橼酸盐缓冲液小容器中，将器置于另一个盛有自来水的大容器中，电炉加热至沸腾，等小容器的温度达92～98℃时，再持续15-20min，然后端离电炉，室温自然冷却，经双蒸水、PBS洗后，下接免疫组织化学步骤。39PPT课件4)电炉加热抗原修复法

切片脱蜡到水后置金属切片架上，放到盛有枸橼酸盐缓冲液的烧杯内，于电炉上加热，当温度达到95℃时关闭电源，当温度下降时重开电源。如此反复，维持10min.抗原修复液-枸橼酸盐缓冲液的pH值很重要，不同的抗体进行免疫组织化学染色时抗原修复所需最佳pH值需要摸索或查阅有关资料。石蜡切片热修复适于核抗原，易被固定破坏的抗原。石蜡切片酶消化程序适于被固定遮蔽的抗原。40PPT课件

温度修复液的pH值抗原热修复的基本原则二个主要因素：41PPT课件抗原热修复温度和时间的关系时间(分钟)100°C80°C60°C5×

2+++--5×6+++++++-5×10-+++++-10小时--++NGF单克隆抗体免疫组化灵敏度实验42PPT课件在一定范围内，加热温度（T）X加热时间（t）=抗原热修复的有效性

高温可以缩短修复时间低温需要更长的修复时间某些蛋白（抗原）需要较低温度的修复43PPT课件微波炉修复和高压锅修复的比较温度压力时间受热微波炉100°C1P15~20分钟不均匀高压锅120°C1.2P喷气2分钟均匀44PPT课件单克隆抗体CD3

克隆系：PS1(PH6.0)微波炉10min高压锅2min45PPT课件

试验了七种不同的缓冲液，pH值从1-10

九种单克隆抗体，阳性表达部位包括胞核、胞浆、胞膜试验结果归纳为四种曲线pH值对抗原热修复的影响46PPT课件抗原热修复:pH值的影响47PPT课件A稳定型抗体：pH值改变对实验结果影响不大

B“V”型抗体：强酸强碱修复液效果好，但强酸条件下，细胞皱缩变形，影响观察

C上升型抗体：修复液pH值越高，效果越好

D下降型抗体：适用于酸性修复液四种类型的抗体48PPT课件

大多数试验室用枸橼酸盐缓冲液（pH6.0),

优点背景清晰高pH值的修复液适用于大多数的抗体如使用pH9.0的修复液，可适当提高一抗的效价pH值是抗原热修复的关键因素49PPT课件抗原修复50PPT课件D2-40：不同pH值修复液对比

1:150

pH6.01:300pH9.051PPT课件说明CD151:50,HIERCipH6CD151:100,HIERTris/EDTApH952PPT课件ER:同一浓度不同修复液比较pH6.0pH9.053PPT课件

固定时间对修复的影响54PPT课件

固定时间越长，需要的修复强度越强同等修复条件下，必须延长修复时间或提高修复的强度

固定时间对抗原修复的影响55PPT课件多克隆抗体S-100

神经纤维及恶黑肿瘤细胞均为阳性表达单克隆抗体S-100

神经纤维阳性恶黑肿瘤细胞无阳性表达中性福尔马林固定48小时中性福尔马林固定72小时56PPT课件

目的—

减低非特异性杂交

时间—Bio/Dig探针可缩短为15min杂交后的冲洗57PPT课件4抗体的稀释度(1)抗体的浓度工作抗体滴度：抗体在稀释液中的浓度，每毫升溶液中所包含的抗体分子愈多,则溶液的滴度亦愈高。选择标准：待测抗原着色最强、背景着色最弱的滴度。微量加样器:为10ul、20ul、50ul、100ul和200ul。抗体稀释后应充分混匀。抗原与抗体浓度的比例十分重要。抗体浓度过高，反而减少抗体与抗原的结合，导致假阴性，当使用一种新抗体时，必须试用多种稀释度，应根据抗体和待染标本等具体情况，确定最佳工作滴度，以防止假阴性结果的出现。影响稀释度因素：标本的固定、切片种类、稀释液种类、湿盒的具体条件等。58PPT课件(2)抗体的稀释方法1)直接测定法：其它条件稳定，用于测定一抗最佳稀释度或直接染色法，以确定第一抗体的最佳稀释度。从表中可知在1:100与1:200间可找出第一抗体的最佳浓度。一抗稀释度特异性染色强度非特异性染色强度1:50++++++1:100++++1:200++－阴性对照－－59PPT课件2)棋盘(方阵)测定法：欲测知二种以上抗体的最佳浓度，可比较9张标本的阳性反应和背景着色。从下表可知，应采用1：20的第二抗体，并进一步在l:50～1:100之间寻找第一抗体的最佳工作稀释度。表3-2抗体的最佳滴度测试表第二抗体第一抗体稀释度1：501：1001：2001：20++++（++）++（－）+（－）1：40++（－）+（－）+（－）1：80+（－）+（－）+（－）注：括号内为背景着色60PPT课件(3)抗体稀释液:0.0lmol／LPBS、Tris缓冲液专用抗体稀释液(含5％BSA，0.1％NaN3，0.025％TritonX100／PBS)稀释后抗体的放置时间不宜过久5滴加抗体技术

正常动物血清处理后,倾去多余血清,滴加一抗,其他抗体均在玻片经PBS洗后滴加。拭去组织周围的液体,勿使组织干燥;

尽快滴加抗体,

须局限于组织上而成一液滴。轻轻摇动切片数秒钟,避免假阴性小区。61PPT课件6抗体孵育(1)时间:

抗体孵育时间越长非特异背景染色越低，特异性抗原染色对比度越佳。(2)温度:

影响待测抗原染色强度、抗体稀释度的重要因素。

37℃为获得抗原抗体结合最大强度的适宜温度（37℃恒温箱孵育10min）。孵育温度愈低，则所需孵育时间愈长，抗体稀释度愈高。使用高度稀释的抗体，可将切片置于4℃冰箱内过夜(约18h)，一抗孵育：4度过夜（最佳）、室温、37度（1-2h)4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45分钟因故必须停止实验的时，将切片置于4℃冰箱内PBS染缸内数小时甚至数日，并不影响染色强度。二抗孵育：一般室温获37度30min-1h62PPT课件

7PBS洗涤

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。单独地进行冲洗，冲洗的PBS为一次性，保证切片没有相互交叉污染的机会。

（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求。中性及弱硷性条件（PH7-8）利于免疫复合物的形成，酸性条件利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是PBS缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，过酸或偏碱，都将影响染色的结果。63PPT课件8显色时间的控制---以DAB为例（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色：抗体浓度过高或孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间；（3）很短时间就出现背景很深：可能封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色可能抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；封闭时间过长。9免疫酶组织化学染色的对照实验．染色中必须有阳性和阴性对照。新抗体:重复检验该抗体对正常组织和相关抗原阳性组织等的染色结果，检验其特异性与敏感性；探讨抗体最佳稀释度。

用同种动物的非免疫血清作为第一抗体的替代物组织切片+非免疫血清阴性结果证明阳性结果不是抗体以外混杂血清成分所致，而是该抗体特异性结果。64PPT课件若是新的组织标本：均应搭配以下对照切片(1)阳性对照片：可选用其它组织标本并行固定、包埋、染色，并且经该抗体证实为中等阳性反应。(2)阴性对照片：仍用上述相同程序，证实其免疫反应为阴性；待检标本上滴加PBS以及同种非免疫动物血清以代替第一抗体，用以检查抗体的特异性。若仅滴加第一抗体的标本阳性，说明特异性高。65PPT课件表3-3免疫酶组织化学对照试验及判断标本号实验组阳性对照阴性对照替代抗体对照结论1++一一受检标本含抗原2一+一一受检标本不含抗原3一一一一操作错误4++++非特异性染色5++一+非特异性反应6+一一一阳性对照差注：①一批抗血清做一次对照实验即可。

②必须用连续切片普通染色组进行对照。66PPT课件10染色结果的评价如何正确评价免疫组化染色结果?除上述对照实验结果分析外，还必须从以下几个方面进行评价。(1)阳性染色特点1）阳性细胞染色分布类型：胞浆、胞核、胞膜。2)阳性细胞分布呈现灶性／弥漫性。3)阳性细胞染色强度不一。若细胞间染色强度相同，常常提示为非特异性反应。4)阳性反应定位于单个或若干细胞，且与阴性细胞相互交杂分布。而非特异性反应常常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。5)切片边缘、刀痕、皱折处或坏死挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常常表现为相同的阳性染色强度，但不能用于判断阳性。67PPT课件(2)染色失败的原因无色片：无任何阳性反应两种可能：---真阴性结果。---假阴性结果：1）切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。选择错切片、抗体、蜡块。2）染色过程中的某环节出了问题：如未进行抗原修复；选用只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；抗体长期不用和/或已超过有效期；染色过程中漏掉了某环节，如忘加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。

3）抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。

解决阴性染色的问题就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。68PPT课件

全片着色：是指整个切片全都染上颜色，着色强度可深可浅，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。原因：

（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。用新抗体前应对其工作浓度进行测试，不能简单按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：严格执行操作规程，佩带报时钟；要根据染色结果进行调整。

（3）DAB变质和显色时间太长：DAB现用现配；DAB显色在显微镜下监控，避免显色时间过长。

（4）组织变干：避免液体流失，提高操作速度。

（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）。（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期；新抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

69PPT课件切片边缘着色原因：（1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。（2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。

“阴阳脸”着色指组织一半着色一半无着色，形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。原因：（1）是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部。（2）染片盒不平，切片倾斜，虽然开始试剂已全部覆盖了组织，但后来试剂流向一边，部分组织未被试剂覆盖。（3）气泡阴阳分明的着色，只是不着色区域是圆形，由于气泡中含气，试剂被推到周围，因此，气泡中心的组织不着色。70PPT课件灶片状着色

切片中着色区东一块西一块，呈灶片状分布。原因：（1）裱片时水未排尽，在局部形成气泡使组织突起，染色时试剂渗入后不易洗尽，显色过深所致。（2）坏死组织灶：组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解，复杂的肽链残段（如Fc段）可能与一抗或/和二抗结合导致最终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。（3）制作APES胶片时，胶的浓度太高，干燥后在玻片上留下白色小点，显色时白色小点着色。间质着色

着色部位主要在间质。原因：（1）抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色（血清封闭可避免）。（2）血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质，很容易与抗体结合，造成间质着色。（3）抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色。

71PPT课件细胞浆着色

胞浆着色是所有“杂音”染色中最具有欺骗性的着色，着色区局限在细胞内，间质无着色，看上去与真实的免疫反应着色几乎一样，很难区别。原因：（1）胞浆里含有较多的蛋白质，因此，很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色，可以通过血清封闭解决。（2）因内源酶造成的着色，可用过氧化氢进行封闭。（3）内源性生物素的着色最具有欺骗性，因为它广泛的存在于组织细胞中，冰冻组织中存在内源性生物素，经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭，加热抗原修复后造成内源性生物素暴露，内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同，从弱阳性（+）到强阳性（+++），内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中，内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织。细胞核着色

不适当的组织处理可以出现细胞核着色。如组织在二甲苯、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少，未没过组织等。72PPT课件对照/标本无染色

①忽略某种试